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TRABAJO PRÁCTICO N°2
Introducción al diagnóstico virológico Parte 2: Técnicas Serológicas
aplicadas al diagnóstico directo e indirecto de enfermedades virales.
OBJETIVOS:
1- Conocer distintas técnicas disponibles para el diagnóstico virológico
identificando los materiales necesarios para realizarlas.
2- Reconocer diferencias entre las técnicas serológicas disponibles en relación a
criterios de sensibilidad y especificidad.
3- Analizar una publicación científica identificando sus partes y comprendiendo
dos metodologías empleadas en el diagnóstico de la Leucosis Viral Bovina.
TEORÍA
Al igual que la mayoría de los microorganismos, los virus se pueden
descubrir ya sea de una forma directa o indirecta. Las pruebas directas son las
que evidencian al virus o algunos de los antígenos virales que se pueden
encontrar presentes en los tejidos o fluidos de los animales infectados (proteínas
virales estructurales, no estructurales o su genoma). Por otro lado, las pruebas
indirectas son las que se utilizan con más frecuencia y demuestran un contacto del
huésped con el agente viral mediante la determinación de anticuerpos específicos.
(Figura 1).
Figura 1: Resumen de los métodos de diagnóstico virológico
1
La Serología aprovecha la habilidad de los organismos de defenderse ante
una infección. Esta defensa incluye diferentes mecanismos específicos e
inespecíficos, de los cuales los inespecíficos son innatos e incluyen mucosas,
sistemas mecánicos, macrófagos, etc. (inmunidad innata). Algunos componentes
de este sistema constituyen la base sobre la que funciona el sistema de inmunidad
especifica o adaptativa, dado que es un sistema que se desarrolla tras la
fagocitosis y exposición de un antígeno por los macrófagos, para su posterior
reconocimiento e interacción con los linfocitos que estimula la formación de
anticuerpos específicos. Estos anticuerpos específicos generados en el curso de
una infección viral, nos permiten reconocer que el virus está o estuvo en ese
animal. Tras una infección, la presencia de anticuerpos se puede detectar en
general en un plazo de entre 15 y 30 días. Cuando un animal entra en contacto
por segunda o consecutiva vez con un antígeno al que ya ha estado expuesto se
produce una respuesta más alta, durante más tiempo y tras un periodo más corto
de latencia (periodo entre la infección y la aparición de anticuerpos en la
circulación). La respuesta ante una primera infección se llama respuesta primaria,
y está mediada por la aparición en sangre de anticuerpos del tipo IgM, mientras
que la respuesta seguida se denomina respuesta secundaria, mediada
principalmente por anticuerpos del tipo IgG. Entonces, durante el período agudo
de una infección viral, predominarán en suero anticuerpos del tipo IgM, mientras
que los anticuerpos IgG aparecerán en sangre, una vez que el animal haya podido
responder con sus defensas y resolver la infección, y en general permanecerán
altos durante largos períodos de tiempo o toda la vida (Figura 2). Por tanto, la
determinación de anticuerpos IgG, nos permite saber si el animal ha estado
previamente en contacto o no con determinado virus, mientras que la
determinación de IgM, nos sirve para saber que el animal está en el período agudo
de una infección viral determinada. Por último, es importante mencionar que en
caso de animales que hayan recibido una vacuna contra determinado virus, para
el cual se disponga de este sistema de inmunización pasiva, estos animales
presentaran en su sangre anticuerpos de respuesta secundaria, y es muy
importante poder determinar en ellos la cantidad de estos anticuerpos (IgG), pues
de ellos dependerá que dicho animal esté protegido frente al virus contra el cual se
lo vacunó.
2
Figura 2: Diferencia entre la cinética de anticuerpos IgM e IgG
Por todo lo antes expuesto, comprender los mecanismos inmunitarios
asociados a una infección viral es muy importante, pues dado que la virología es
una ciencia emergente, las técnicas de inmunología se han ido desarrollando a la
par de los avances en éste campo, y estas dos disciplinas están por tanto
íntimamente relacionadas. La inmunología es una disciplina que por sí misma ha
contribuido en gran medida al desarrollo de muchas técnicas clásicas utilizadas en
la virología. A partir de los años 1960 se han desarrollado diversos métodos
basados en reacciones inmunológicas in vitro que han sido y son utilizados en el
diagnóstico virológico; entre ellas podemos mencionar: Inhibición de la
hemaglutinación, Test de doble difusión, Inmunofluorescencia, ELISA, Western
blot, etc. Todas estas técnicas varían en parámetros como la sensibilidad y la
especificidad, así como en la rapidez de su realización, complejidad técnica y
costo. Hoy en día, se cuenta con una amplia variedad de pruebas serológicas
aplicadas al diagnóstico virológico tanto directo como indirecto, y que son en gran
medida la principal herramienta disponible en muchos laboratorios que se dedican
al diagnóstico virológico. Todos estos ensayos tienen la particularidad de
aprovechan las características fisicoquímicas de los anticuerpos, así como su
especificidad, para determinar la presencia de virus (normalmente algún
componente en particular de los mismos) y/o la respuesta inmune específica para
determinado patógeno viral.
A continuación se desarrollará con detalle algunas de las técnicas
serológicas más utilizadas en virología veterinaria a fin de que puedas
familiarizarte con los fundamentos de las mismas.
3
1- INMUNOFLUORESCENCIA
Los fluoróforos son moléculas que tienen la particularidad de emitir luz a
una determinada longitud de onda, cuando son excitados con luz de otra
determinada longitud de onda. De este modo, podemos utilizar esta propiedad
para visualizar la reacción antígeno anticuerpo. La técnica de inmunofluorescencia
(IF) utiliza anticuerpos conjugados con fluoróforos y la reacción antígeno
anticuerpo se visualiza utilizando un microscopio de fluorescencia.
IF DIRECTA
La IF directa, es una prueba serológica directa porque ESTUDIA ANTÍGENOS
VIRALES.
Recordemos que las pruebas serológicas directas son aquellas que
basadas en el principio de la reacción antígeno anticuerpo investigan la presencia
del antígeno. En el caso de la enfermedad infecciosa equivale a decir que
investigan la presencia del agente etiológico o uno de sus componentes. Por
ejemplo, el diagnóstico de virus de la rabia, se realiza actualmente por dos
técnicas aprobadas por el SENASA: la inoculación intracerebral al ratón y la
inmunofluorescencia directa. La IF directa se basa, en este caso, en la detección
de proteínas virales en improntas de tejidos de animales presuntamente
infectados, a partir de la utilización de anticuerpos específicos (monoclonales o
policlonales) conjugados con una molécula fluorescente (Figura 3).
Figura 3: IF directa
IF INDIRECTA
La técnica de IF indirecta utiliza un anticuerpo primario y un anticuerpo
secundario conjugado con un fluoróforo (es decir, un anticuerpo dirigido contra el
anticuerpo primario, un anti-anticuerpo). Este doble uso de anticuerpos aumenta la
sensibilidad de la técnica, ya que, como podemos observar en la Figura 4, más de
un anticuerpo secundario, puede unirse al anticuerpo primario, amplificando la
señal. Observa que en este caso podríamos utilizar este procedimiento con la
misma finalidad que la técnica directa (la diferencia es que en este caso la técnica
indirecta sería más sensible para reconocer antígenos virales), o podríamos
utilizar la muestra de nuestro suero problema (que presumiblemente contiene
anticuerpos contra determinado virus), como reemplazo del anticuerpo primario y
de este modo la técnica de inmunofluorescencia indirecta nos estaría sirviendo
4
para determinar si nuestro suero presenta o no anticuerpos para determinado virus
que queramos identificar. Entonces, observa que en este último caso, si bien la
técnica de IF indirecta también está basada en la reacción antígeno anticuerpo,
investiga no ya, el agente viral en sí, sino la huella que dejó éste al pasar por su
huésped en términos de una respuesta inmune puesta en evidencia por el
hallazgo de anticuerpos específicos contra el agente. Indirectamente permite
suponer que el agente en cuestión estuvo presente en el huésped en algún
momento.
Actualmente la técnica de IF indirecta es utilizada para realizar el
diagnóstico indirecto de: virus del síndrome respiratorio y reproductivo porcino y el
virus de la diarrea epidémica porcina. En ambos casos se detectan anticuerpos
específicos en el suero de los animales, a partir de la utilización de Kits
comerciales aceptados por el SENASA.
Figura 4: Inmunofluorescencia indirecta
"RECUERDA QUE LA TÉCNICA DE IF INDIRECTA PUEDE SER UTILIZADA EN SEROLOGÍA
PARA DETERMINAR LA PRESENCIA DE ANTICUERPOS FRENTE A UN DETERMINADO
PATÓGENO VIRAL, ES DECIR PUEDE SER UTILIZADA COMO UNA TÉCNICA DE
DIAGNÓSTICO INDIRECTO."
2- ENZIMO INMUNO ANÁLISIS
La prueba de ELISA (enzyme linked imunosorbent assay) se fundamenta en
la reacción antígeno anticuerpo, utilizando una superficie o fase sólida
(micropocillos), sobre las cuales se encuentran fijos antígenos o anticuerpos,
dependiendo si el formato de ELISA es directo o indirecto (Figura 5 y 6
respectivamente). Además, la prueba cuenta con un anticuerpo conjugado a una
enzima, la cual es capaz de catalizar una reacción con un sustrato, generando un
producto, el cual solo estará presente si la prueba es positiva. De esta forma, el
color del medio de reacción en presencia del sustrato es uno, mientras que
cuando este sustrato se modificó, por la acción de la enzima a producto, se
produce un cambio en el color del líquido presente en el pocillo de reacción,
determinando este cambio, que la prueba es positiva.
5
Figura 5: ELISA directo
Figura 6: ELISA indirecto
ELISA DIRECTO
En este inmunoensayo en fase sólida, se fijan los anticuerpos comerciales
específicos para el virus en la superficie de una matriz, tubo o microplaca y luego
se pone en presencia del suero o muestra que contiene el antígeno que se quiere
demostrar. Una vez que ocurre la reacción antígeno-anticuerpo, se realizan
lavados para eliminar los anticuerpos no unidos y se agrega un anticuerpo
marcado con una enzima que puede ser la fosfatasa alcalina (FAL) o la peroxidasa
de rábano (HRP) y para revelar la reacción se coloca el sustrato específico para la
enzima que es modificado por ésta produciendo un compuesto coloreado que
cambia el color del medio de reacción. Para la cuantificación, se mide la
absorbancia en una longitud de onda determinada en un espectrofotómetro. La
absorbancia será directamente proporcional a la cantidad de antígeno en la
muestra, de modo que a mayor intensidad de color, mayor cantidad de antígeno
hay en la muestra (Figura 7 izquierda).
6
Estas técnicas se utilizan ampliamente en el diagnóstico de: virus
respiratorio sincicial bovino, coronavirus canino, parainfluenza, diarrea vírica
bovina, entre otros.
ELISA INDIRECTO
Estas técnicas serológicas se emplean para determinar la existencia de
anticuerpos contra determinado agente viral, teniendo en cuenta que la exposición
al agente produce una respuesta por parte del sistema inmune que genera la
producción de anticuerpos específicos. En este caso, un antígeno específico está
unido a una fase sólida que puede ser un tubo, microplaca o perlas de vidrio;
luego se añade el suero del paciente que posee los anticuerpos específicos para
ese antígeno y después se adiciona el conjugado constituido por un antianticuerpo comercial IgG o IgM unido a una enzima. Posteriormente se adiciona el
sustrato específico para la enzima, que lo va a modificar y producir un compuesto
coloreado, cuya intensidad es proporcional a la concentración de anticuerpo en el
suero del paciente (Figura 7 derecha).
7
Figura 8: Pasos en la elaboración de ELISA DIRECTO e INDIRECTO
8
3- WESTERN BLOT
Consiste en un método analítico que permite reconocer proteínas virales o
los anticuerpos específicos dirigidos especialmente hacia ellas. Esta técnica será
desarrollada con más detalle en el Trabajo práctico N°5, aunque es preciso saber
que es una técnica altamente sensible y específica en la cual se utilizan también
un anticuerpo primario, y un anticuerpo secundario marcado con una enzima, la
cual posteriormente reacciona modificando un sustrato y permitiendo por diversos
métodos evidenciar la presencia de una determinada proteína viral (Figura 8
izquierda), o en el caso de utilizarla para evaluar la presencia de anticuerpos en
una muestra de suero, en donde nuestro anticuerpo primario, será el suero en
cuestión (Figura 8 derecha). Sin embargo es una técnica altamente demandante
en tiempo y técnica, por lo cual no es utilizada en test de diagnóstico rápido, sino
más bien en estudios de confirmación, y principalmente en investigación, como
herramienta para cuantificar una o más proteínas virales.
.Figura 8: Esquemas de la técnica de Western blot directa (izquierda) e indirecta
(derecha)
4- INMUNODIFUSIÓN DOBLE DE OUCHTERLONY
La prueba de inmunodifusión doble, representa una prueba serológica que
puede ser directa (Figura 9) o indirecta (Figura 10) según si lo que estamos
determinando es antígeno o anticuerpo. Además, a diferencia de las pruebas
vistas anteriormente, esta prueba serológica se clasifica dentro de las pruebas de
interacción secundaria, pues no necesitamos de ningún sistema de revelado
adicional para poder ver la reacción, ya que la sola interacción antígeno anticuerpo
genera una banda de precipitación detectable a simple vista.
La precipitación ocurre con la mayoría de los antígenos, debido a que éstos
tienden a ser multivalente, es decir, tienen varios determinantes antigénicos
por molécula, al que los anticuerpos pueden enlazarse. Cada anticuerpo, a su vez,
tiene por lo menos dos sitios de unión para los antígenos, de modo que se
9
entrecruzan formando una gran matriz de agregados antígeno: anticuerpo.
Cuando un anticuerpo es puesto en contacto con el antígeno correspondiente, se
forman complejos antígeno-anticuerpo que se insolubilizan en su mayor parte,
dando lugar a una reacción de precipitación. Empleando soportes adecuados es
posible que los antígenos y anticuerpos migren con diferentes velocidades, de
modo que al encontrarse interaccionen y precipiten. Los geles utilizados como
soporte tienen como base pectina, alginatos, poliacrilamida e incluso pueden
utilizarse tiras de acetato de celulosa gelatinizado. Los precipitados que se
originan se visualizan como bandas.
La técnica consiste en enfrentar en pequeñas perforaciones efectuadas en
el agar, las soluciones de antígeno y anticuerpo. Al difundir y ponerse en
contacto, producirán una banda de precipitación sólo si se encuentran en
concentraciones óptimas. Si esta concentración es la que corresponde a la zona
de equivalencia de la banda de precipitación estará situada aproximadamente en
la distancia media que separa los reservorios. Cuando hay exceso de antígeno o
anticuerpo, la banda estará más próxima al pocillo del anticuerpo o del antígeno,
respectivamente.
Figura 9: Prueba de doble difusión directa
10
Figura 10: Prueba de doble difusión indirecta
5- INHIBICIÓN DE LA HEMAGLUTINACIÓN (IHA)
La hemaglutinación (HA) es un fenómeno inducido por ciertos tipos de
virus, los cuales presentan en su estructura glicoproteínas superficiales
(hemaglutininas) similares a espículas (Figura 11), que se unen a los glóbulos
rojos y son capaces de aglutinarlos y formar en la placa o en un tubo un velo
característico, a diferencia del botón que se forma en aquellas muestras que no
contiene virus y que por tanto no experimentan el fenómeno de hemaglutinación,
en cuyo caso el botón resulta de la precipitación por gravedad de los glóbulos
rojos en ese pocillo. (Figura 12-13).
Una prueba de HA positiva nos habla de un virus hemaglutinante que está
presente en la muestra en estudio, sin embargo la determinación exacta del virus
involucrado en una patología es aún incierta. Por esta razón como siguiente paso
se debe aplicar una prueba que permita la plena identificación del virus.
"La hemaglutinación es una técnica que se utiliza para guiar el diagnostico
directo de virus con propiedades hemaglutinantes, mientras que la IHA es
una técnica serológica de diagnóstico virológico indirecto".
11
Figura 11: Esquema de la estructura de un virus hemaglutinante. Observa las glicoproteínas
expuestas, las cuales son las responsables de la capacidad de hemaglutinación.
Figura 12: Fenómeno de hemaglutinación
Figura 13: Velo por hemaglutinación en muestra con virus hemaglutinante y botón de
glóbulos rojos en muestra sin virus hemaglutinante.
Ahora bien, el fenómeno de hemaglutinación no ocurre si en el medio de
reacción existe la presencia de anticuerpos específicos que sean capaces de
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unirse y bloquear la acción de las glicoproteínas responsables de dicho efecto. Es
decir que, si un anticuerpo específico (presente por ejemplo en el suero de un
animal que queramos investigar) se una a las hemaglutininas, el fenómeno de
hemoaglutinación no se observará, y por el contrario en la placa o en el tubo
vamos a observar un botón de glóbulos rojos precipitados por gravedad (Figura
14). Lo antes explicado constituye el fundamento de la prueba de INHIBICIÓN DE
LA HEMAGLUTINACIÓN.
Como puedes observar en la Figura 14, si en una muestra de suero
determinada no hay anticuerpos específicos contra determinado patógeno viral,
sólo se visualiza hemoaglutinación (velo) porque los antígenos virales del kit que
utilizamos para hacer esta prueba conservan su capacidad de aglutinar los
eritrocitos, pues estas hemaglutininas están expuestas y libres para interaccionar.
Sin embargo, si la muestra presenta anticuerpos que bloquean a dichas
aglutininas, la hemaglutinación se inhibirá y visualizaremos en el fondo de una
placa o un tubo, un botón de hematíes.
Figura 13: Fundamento de la prueba de Inhibición de la Hemaglutinación. Resultado
positivo.
La prueba de IHA se realiza utilizando diluciones seriadas del suero a
analizar (es decir que partimos de una muestra de suero la cual vamos diluyendo
progresivamente, por ejemplo desde una dilución 1/20 a una dilución de 1/640).
Luego estas diluciones se ponen en contacto con antígenos virales específicos y
glóbulos rojos. De este modo, podemos calcular el título de anticuerpos, que es el
valor de la mayor dilución de suero reactivo, es decir, la mayor dilución a la cual el
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suero presente actividad inhibitoria de la hemaglutinación. Por ejemplo, si un suero
es reactivo, es decir inhibe la hemaglutinación, hasta la dilución 1/160, esto quiere
decir que esa dilución representa el título de anticuerpos en esa muestra (Figura
15).
Figura 15: Resultados del test de inhibición de la hemaglutinación. El título de anticuerpos
es 1:80
6- SERONEUTRALIZACIÓN VIRAL
En esta prueba se puede valorar la capacidad que tienen los anticuerpos
presentes en un suero problema para neutralizar la actividad biológica de un
virus.
Varios de los métodos descritos anteriormente permiten valorar la
capacidad que un suero determinado tiene para reconocer un antígeno concreto,
en la seroneutralización se avanza un paso más y se indica la capacidad que tiene
un suero para neutralizar la actividad biológica del virus.
Esta prueba es muy laboriosa y requiere de cultivos celulares en
esterilidad, además de ser generalmente más lenta que todas las anteriores. Sin
embargo es altamente especifica y sensible, y se consideran las pruebas de
referencia para cualquier valoración serológica. En el caso de los virus, se puede
medir la capacidad que un determinado suero tiene para neutralizar la infectividad
del virus sobre una línea celular sensible. Se añade una mezcla de virus a una
concentración constante que previamente ha estado en contacto con diferentes
diluciones del suero problema sobre las células. Se van observando las células
sobre la que se han añadido las distintas diluciones para ver si el virus las ha
infectado o no mediante la tinción con un conjugado o por el efecto citopático. De
esta forma se puede medir la capacidad de neutralización viral de un suero
problema (Figura 15).
La arteritis viral equina, es una enfermedad viral cuyo diagnóstico de
referencia para el SENASA, consiste en la seroneutralización viral.
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Figura 15: Esquema de la prueba de seroneutralización negativa(izquierda) positiva(derecha)
IMPORTANCIA DE LOS CRITERIOS DE SENSIBILIDAD Y ESPECIFICIDAD EN
LA ELECCIÓN DE PRUEBAS DE DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO.
La incorporación de una técnica nueva a un laboratorio debe de estar
precedida de estudios de evaluación. Una prueba serológica se evalúa,
fundamentalmente, por los parámetros de sensibilidad y especificidad. Del
conocimiento de estos valores intrínsecos se deducirá su aplicación o no en
determinadas circunstancias y como deberá interpretarse su resultado ya sea
positivo o negativo.
La medida de la sensibilidad se realiza probando la determinación en
animales que sabemos que están en la situación que queremos diagnosticar (en
este caso serían animales infectados). Cuantos más resultados positivos produzca
en este grupo de enfermos más sensibilidad tendrá la prueba y menos resultados
falsos negativos (FN) obtendremos; definimos pues la sensibilidad como el
porcentaje de verdaderos positivos (VP) que son detectados en individuos con esa
enfermedad y esa técnica. En serología es difícil tener pruebas con el 100% de
sensibilidad y casi todas producen algún resultado negativo falso.
La especificidad se mide, por el contrario, realizando la prueba en
animales que no padecen la enfermedad que queremos diagnosticar con ella. La
especificidad por tanto se define como el porcentaje de verdaderos negativos que
serán detectados en pacientes sanos con esa prueba. Las pruebas apropiadas
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producen, en este caso, gran cantidad de resultados negativos y muy escasos
falsos positivos (FP). Existen muchas pruebas serológicas con especificidades
casi del 100%.
Los dos parámetros antes mencionados son propiedades intrínsecas del
test comercial y no varían nunca con relación a la población estudiada.
Observa la siguiente figura que te ayudará a terminar de comprender los
conceptos de sensibilidad y especificidad.
Figura 16: Representación animada del significado de sensibilidad y especificidad
PRÁCTICA:
1- Resolveremos las dudas del Marco Teórico del TP 2.
2- Formaremos grupos de no más de 4 alumnos, leeremos el artículo: "Estudio
comparativo entre las pruebas de ELISA y doble inmunodifusión en el diagnóstico
de la Leucosis Enzoótica Bovina."
a- Definiremos las partes del artículo.
16
b- Explicaremos la metodología empleada para determinar la seroprevalencia del
virus.
c- Discutiremos los resultados obtenidos con ambas técnicas.
3- Observaremos y reconoceremos los materiales necesarios para realizar las
técnicas serológicas presentadas a continuación, anotando en cada caso las
materiales que correspondan.
-ELISA:
-HAI:
- DD
4- Actividad en el Aula Virtual:
Deberás responder el cuestionario correspondiente al TP 2, el cual se subirá
a la plataforma virtual del Módulo de Virología Año 2015. TODOS deberán
responder el cuestionario. El tiempo del cual disponen para poder completar
el cuestionario es de 6 días (contando desde el Viernes que realizaron el
práctico, hasta el miércoles de la semana siguiente inclusive). Aquel alumno
que no haya entregado el cuestionario en la fecha pactada, no podrá rendir
el examen post-práctico correspondiente al práctico siguiente, y por tanto se
tomará a este práctico como desaprobado.
17
BIBLIOGRAFÍA
Libros y artículos científicos
- Vicente Aguilar García. Reacciones de Aglutinación. 2004. Gac Méd Méx Vol.
140, Suplemento No. 3
- Basualdo Juan A; Coto Celia E; Torres Ramon A. Microbiología Biomédica.
2006.Segunda Edición. Capítulo 72.
- Cann y col. Principles of molecular virology. 2005. 4th edition. El Sevier.
- Morilla, A., Bautista, C., 1986. Manual de Inmunología
- Alonso et al. 1992. Manual dediagnóstico de la boratorio de las enfermedades
vesiculares.
-O.I.E. 1991. Manual of recommended diagnostic techniques and requirements for
biological products.
-César Betancur H, M.Sc, Juan Rodas G. 2008.Seroprevalencia del virus de la
Leucosis Viral Bovina en animales con trastornos reproductivos de Montería.
Rev.MVZ Cordoba vol. 13 no.1
.
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