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ÍNDICE GENERAL
I
LISTADO DE FIGURAS
LISTADO DE TABLAS
VII
XII
ABREVIATURAS
XIV
I. INTRODUCCIÓN
1
1. POSTCOSECHA DE FRUTOS CÍTRICOS
2
1.1 Enfermedades Postcosecha
3
1.2 Principales enfermedades fúngicas postcosecha en frutos cítricos
3
1.3 Control de las podredumbres en postcosecha
5
1.3.1 Fungicidas químicos
1.3.2 Control alternativo
1.3.2.1 Control Físico
1.3.2.2 Control Químico
1.3.2.3 Control Biológico
1.3.2.4 Combinación de tratamientos para el tratamiento integral
de enfermedades
6
7
8
9
10
11
2. BIOLOGÍA DE Penicillium digitatum
13
3. INTERACCIÓN PLANTA-PATÓGENO
18
4. FACTORES DE PATOGENICIDAD Y VIRULENCIA EN HONGOS FITOPATÓGENOS
22
4.1 Reconocimiento del huésped y cascadas de transducción de señales
22
4.2 Genes implicados en el metabolismo de nutrientes esenciales
28
4.3 Enzimas degradadoras de pared celular
29
4.4 Efectores
31
4.5 Producción y detoxificación de toxinas
34
4.6 Especies reactivas de oxígeno
35
4.7 Implicación del pH en patogénesis
38
5. DESARROLLO DE HERRAMIENTAS GENÓMICAS EN HONGOS FITOPATÓGENOS
41
5.1 Aproximaciones a la transformación genética
41
5.2 Recombinación homóloga y no homóloga
42
5.3 RNA interferente
5.4 Proteína verde fluorescente
43
44
6. DESARROLLO DE TÉCNICAS -ÓMICAS EN EL ESTUDIO DE HONGOS
FILAMENTOSOS
46
II.OBJETIVOS
54
III. MATERIALES Y MÉTODOS
56
1. ORGANISMOS
57
1.1. Material vegetal
57
1.2 Microorganismos
57
1.2.1 Hongos
1.2.2 Bacterias
57
58
2. INFECCIONES DE FRUTOS CÍTRICOS CON P. digitatum
58
2.1 Toma de muestras
59
2.1.1 Tejido fruto de naranja infectado con P. digitatum
2.1.2 Micelio de P. digitatum
59
60
2.2 Análisis estadístico
60
3. AISLAMIENTO DE ÁCIDOS NUCLEICOS
60
3.1 RNA de fruto (infectado y no infectado) y de micelio
60
3.2 RNA de conidios
61
3.3 Purificación de mRNA
61
3.4 Extracción de DNA genómico de P. digitatum
61
3.5 DNA genómico de P. digitatum a pequeña escala
62
3. 6 Purificación de DNA plasmídico
62
3.6.1 Purificación de plásmidos a gran escala mediante lisis alcalina
3.6.2 Purificación de plásmidos a pequeña escala mediante lisis alcalina
3. 7 Purificación de DNA de fósmidos
62
63
63
3.7.1 Purificación de DNA de fósmido a gran escala por lisis alcalina
63
3.7.2 Purificación de DNA de fósmido a media escala por el método de
ebullición
64
3.7.3. Purificación de DNA de fósmido a media escala sin amplificación previa 64
4. ANÁLISIS NORTHERN
64
4.1. Preparación de las membranas
64
4.2 Marcaje de sondas
65
4.3 Hibridaciones y análisis de datos
65
5. OBTENCIÓN DE CÉLULAS COMPETENTES Y TRANSFORMACIÓN
66
5.1 Preparación y transformación de células quimio-competentes de E. coli
66
5.2 Preparación de células electro-competentes de E. coli
66
5.3 Preparación de células electro-competentes de Agrobacterium tumefaciens
67
6. SECUENCIACIÓN
68
6.1 Análisis de secuencias
68
7. CONSTRUCCIÓN DE VECTORES
68
7.1 Diseño de oligonucleótidos
69
7.2 Preparación de vectores
71
7.2.1 Linearización de los vectores
7.2.2 Reacción de clonación USER
7.2.3 Transformación
71
72
72
8. CONSTRUCCIÓN DEL PLÁSMIDO PRF-HU2Fle
73
9. CONSTRUCCIONES DE RNA INTERFERENTE
74
10. TRANSFORMACIÓN DE P. digitatum MEDIANTE A. tumefaciens
75
10.1 Transformación de P. digitatum mediada por A. tumefaciens
75
10.2 Estabilidad mitótica de los transformantes
76
11. CONSTRUCCIÓN DE UNA GENOTECA SUSTRACTIVA DE cDNA ENRIQUECIDA
EN GENES DE P. digitatum INDUCIDOS DURANTE LA INFECCIÓN DE FRUTOS
CÍTRICOS
11.1 Hibridación sustractiva mediada por PCR supresiva (SSH)
76
76
11.2 Elaboración e hibridación de una macromatriz de cDNA
77
11.3 Análisis de las hibridaciones de las macromatrices
78
12. CONSTRUCCIÓN DE UNA GENOTECA DE DNA GENÓMICO DE P. digitatum
79
13. SECUENCIACIÓN DE GENES DE INTERÉS DESDE LA GENOTECA DE DNA
80
13.1 Cribado de la genoteca
80
13.2 Obtención de secuencias de los genes
81
14. PCR EN TIEMPO REAL PARA LA CUANTIFICACIÓN DEL NÚMERO DE
COPIAS DE DNA
84
14.1 Reacción de PCR en tiempo real
85
15. MICROSCOPÍA DE FLUORESCENCIA
86
IV. RESULTADOS
1.
HERRAMIENTAS GENÓMICAS
88
89
1.1 Construcción de una genoteca de DNA genómico de P. digitatum
89
1.2 Transformación de P. digitatum mediada por A. tumefaciens
(ATMT)
90
1.2.1 Sensibilidad de P. digitatum a higromicina
1.2.2 Transformación de P. digitatum
1.2.3 Análisis molecular de los transformantes
1.2.4 Estabilidad mitótica de los transformantes
1.2.5 Optimización del sistema ATMT para P. digitatum
1.3 Proteína verde fluorescente (GFP, green fluorescent protein)
1.3.1 Vectores de expresión de la proteína verde fluorescente
1.3.2 Microscopía
1.3.3 Ensayos de infección transformantes de GFP
1.4 Obtención de mutantes de P. digitatum carentes del gen ku80
1.4.1 Obtención y caracterización de un mutante de P. digitatum carente
del gen ku80
1.4.2 Comprobación número de copias mediante PCR en tiempo real
1.4.3 Análisis morfológico
1.4.4 Ensayos de infección
1.5 Uso de fleomicina como marcador de selección en P. digitatum
1.5.1 Sensibilidad de P. digitatum a fleomicina
1.5.2 Diseño del vector pRF-HU2Fle
1.5.3 Transformación de P. digitatum con el vector pRF-HU2Fle
90
90
91
91
92
93
93
94
96
96
101
103
105
106
107
107
108
109
1.6 Obtención de plásmidos binarios de RNA interferente para P. digitatum
110
2. FACTOR DE TRANSCRIPCIÓN PacC
111
2.1 Clonación y secuenciación del gen pacC de P. digitatum
112
2.2 Análisis de la secuencia del gen pacC de P. digitatum
115
2.3 Análisis de expresión de pacC
116
2.4 Obtención de mutantes pacC de P. digitatum
2.4.1 Construcción del plásmido de sobreexpresión pRF-HUE-pacCc
2.4.2 Construcción del plásmido de expresión constitutiva pRF-HU2-pacCc
2.4.3 Construcción del plásmido de deleción pRF-HU2-ΔpacC1
2.4.4 Construcción del plásmido de deleción pRF-HU2-ΔpacC2
118
118
119
120
121
2.5 Transformación de P. digitatum con los plásmidos pRF-HU2-pacCc,
pRF-HU2-ΔpacC y pRF-HUE-pacCc
122
2.5.1 Ensayos de infección transformantes de PacC
123
3. IDENTIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE GENES DE P. digitatum QUE SE
INDUCEN DURANTE EL PROCESO DE INFECCIÓN DE FRUTOS CÍTRICOS
124
3.1 Secuenciación y análisis de las secuencias de clones de la genoteca PDS
127
3.2 Análisis de expresión de los clones presente en la genoteca PDS
129
3.3 Anotación funcional de las secuencias
134
3.4 Análisis de la expresión génica mediante hibridación Northern
136
4. ANÁLISIS DE GENES PRESUNTAMENTE IMPLICADOS EN
PATOGENICIDAD/VIRULENCIA
140
4.1 Poligalacturonasa 1 (pg1)
140
4.2 Poligalacturonasa 2 (pg2)
143
4.3 Pectin liasa (pnl1)
147
4.4 Proteína Rieske (ris1)
150
4.5 Obtención de mutantes nulos de P. digitatum en los genes pg1, pg2, pnl1
y ris1
4.5.1 Comprobación del número de copias de los transformantes
mediante PCR tiempo real
154
156
4.6 Análisis morfológico de los mutantes nulos Δpg1, Δpg2, Δpnl1 y Δris1
de P. digitatum
158
4.7 Ensayos de infección de los mutantes nulos Δpg1, Δpg2, Δpnl1 y Δris1
de P. digitatum
159
V.DISCUSIÓN
165
1. DESARROLLO DE HERRAMIENTAS GENÓMICAS PARA P. digitatum
166
1.1 Uso de la proteína verde fluorescente para el estudio de P. digitatum
168
2. IMPLICACIÓN DEL FACTOR DE TRANSCRIPCIÓN PacC DE P. digitatum EN
PATOGENICIDAD
170
3. NUEVAS ALTERNATIVAS PARA LA OBTENCIÓN DE MUTANTES CON
EXPRESIÓN REDUCIDA DE GENES DIANA
173
3.1 Obtención de mutantes nulos ku80 (Δku80)
173
3.2 RNA interference (RNAi)
175
4. APLICACIÓN DE HERRAMIENTAS GENÓMICAS EN EL ESTUDIO DE LA
INTERACCIÓN P. digitatum- FRUTO CÍTRICO
175
4.1 Identificación de genes de P. digitatum que se inducen durante la infección
de frutos cítricos
175
4.2 Respuesta a estrés y detoxificación
178
4.3 Enzimas relacionadas con la pared celular
182
4.4 Resistencia a fungicidas
189
4.5 Glucólisis
192
4.6 Transducción de señales
192
4.7 Otras proteínas
193
5. PROTEASAS
194
VI. CONCLUSIONES
199
VII. BIBLIOGRAFÍA
201