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XIX Verano de la Investigación Científica y Tecnológica del Pacífico
EVALUACIÓN DE MÉTODOS DE CONSERVACIÓN POR EL MÉTODO DE
MILES Y MISRA.
Laura Angélica Robles Chávez, Facultad de ingeniería, universidad autónoma de baja
california, [email protected], M. en C. Marcos Daniel Martínez Peña, Centro Nacional de
Recursos Geneticos (CNRG-INIFAP) [email protected]
PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Gardnerella vaginalis son bacterias
que presentan el fenómeno de autolisis por lo que su conservación se dificulta por
los diversos métodos de conservación a largo plazo. El objetivo fue evaluar tres
métodos de conservación, liofilización, ultracongelación a -80oC y vitrificación, los
métodos se evaluaron mediante el método de Miles y Misra antes y después de la
conservación, para determinar cuál es el mejor método de conservación para estas
bacterias.
METODOLOGÍA
Se reactivaron las cepas criopreservadas o liofilizadas mediante siembra por estría
cruzada y se incubaron a 35 C en atmosferas de CO2 al 5%, para verificar la
viabilidad y pureza. Se sembraron por estría masiva para obtener suficiente biomasa
de las cepas para hacer una suspensión de bacterias ajustada al tubo N.° 7 del
Nefelómetro de McFarland que representa aproximadamente 2,100x106/ml
bacterias. Para liofilizar las cepas se colocaron 500 µL de solución bacteriana y 500
µL de leche al 20% en un criovial, se colocó una tapa; los crioviales llenos se
congelaron a -70 °C por 24 h y después se colocaron en la liofilizadora, el proceso
duró 3 días con base al protocolo de liofilización de la CM-CNRG. Para
crioconservar se colocaron 500 µl de suspensión bacteriana y 500 µl de caldo ToddHewitt con glicerol al 20% en criotubos, por triplicado para cada cepa. Las cepas se
congelaron a –20°C por 24 h, después se transfirieron al ultracongelador a -80 oC y
al tanque de nitrógeno líquido a -196 oC. En caldo tioglicolato y se realizaron
diluciones seriadas 1:10 desde 1x10-1 a 1x10-12, se inocularon cajas con gel de las
ultimas 6 diluciones, se incubaron y contaron las UFC/mL. Se consideró un método
adecuado cuando la pérdida de viabilidad fuera menor a un log después del proceso
de conservación, el método se realizó antes y después del proceso de conservación.
.
RESULTADOS Y CONCLUSIONES
La Gardnerella vaginalis y la Neisseria meningitidis se evaluaron después del
método de conservación por Miles y Misra, teniendo colonias incontables tanto en
el método de liofilizado como en el de crioconservación. Hasta el momento se puede
observar que los tres métodos son viables con las condiciones aplicadas para estas
cepas ya que no se pierde más de un log de viabilidad.
© Programa Interinstitucional para el Fortalecimiento de la Investigación y el Posgrado del
Pacífico
Agosto 2014