Download PROBLEMA 8

Survey
yes no Was this document useful for you?
   Thank you for your participation!

* Your assessment is very important for improving the work of artificial intelligence, which forms the content of this project

Document related concepts

Adenoviridae wikipedia, lookup

Receptor de estrógeno beta wikipedia, lookup

Transcript
PROBLEMA 8
REGULACIÓN DEL RECEPTOR DE ESTRÓGENO  POR FOSFATASAS DE LA FAMILIA 2A
El receptor de estrógeno  (ER) media los efectos de la hormona alterando la expresión de
determinados genes luego de la unión a su ligando. Se ha demostrado que la fosforilación del ER
por MAP quinasa induce su actividad transcripcional en ausencia de ligando.
El objetivo general del trabajo es demostrar que las fosfatasas de proteínas tipo 2A (PP2A) regulan
la acción del ER contrarrestando la fosforilación mediada por MAP quinasa.
Primero se busca demostrar la interacción del ER con la subunidad catalítica de PP2A (PP2Ac),
expresando el ER humano en la línea celular Rad91 (endotelio de vena pulmonar de rata), que
carece de ER, para realizar ensayos de co-inmuprecipitación. Luego se desea probar que la
actividad transcripcional de ER es regulada negativamente por fosfatasas tipo PP2A mediante un
ensayo de genes reporteros, empleando ácido okadaico para inhibir la actividad de PP2A.
Los objetivos particulares de este trabajo son:
A. Expresar el ER en células Rad91 mediante vectores virales basados en adenovirus.
B. Realizar sobre dichas células un ensayo de co-inmunoprecipitación para demostrar la
interacción entre ER y PP2A (resultados mostrados en la figura 1).
C. Realizar sobre las células obtenidas en A un ensayo de genes reporteros (empleando la
secuencia del elemento de respuesta a estrógeno) para demostrar que la actividad de
PP2A tiene un efecto inhibitorio sobre la actividad transcripcional de ER, utilizando el
inhibidor de PP2A ácido okadaico (resultados mostrados en la figura 2).
Actividades:
1- Describir en forma detallada los pasos a seguir (diseño de primers, sistema de vectores virales,
construcción de los vectores, producción de virus recombinantes en células empaquetadoras,
infección células target, verificación de la expresión, etc) para realizar el objetivo A.
Representar mediante esquemas, gráficos, geles, etc. los resultados que espera obtener en
cada paso del clonado. Nota: la región codificante del ER humano se encuentra clonada en
un vector pGem-T-easy.
2- Describir brevemente los resultdos que se realizaron en el experimento de la figura 1.
3- Describir la estrategia general para realizar el experimento de la figura 2 (esquematice los
vectores empleados).
4- Comentar brevemente los resultados obtenidos.
Nota: el gen que codifica para el ER humano es el ESR1 (transcript variant 1)
Figura 1: Las células fueron lisadas e inmunoprecipitadas
con anticuerpo anti-ER (IP-ER), o IgG no inmune (NI) y los
pellets resultantes fueron resueltos por SDS-PAGE,
transferidos a membranas de nitrocelulosa e
inmunodetectados con anticuerpos anti-PP2A (IB:PP2A)
o anti-ER (IB:ER).
ER+: Rad91 infectadas con adenovirus-ER
ER-: Rad91 infectadas con adenovirus (sin ER, vector
vacío)
Figura 2: Ensayo de genes reporteros
E2: 17-estradiol (estrógeno)
OA: ácido okadaico
Related documents
3 Angiotensina II e
3 Angiotensina II e