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DISTRIBUCIÓN ESPACIAL DE MICROORGANISMOS DESNITRIFICANTES EN UN
HUMEDAL ARTIFICIAL DEL PARQUE NACIONAL DE DOÑANA
Correa D.a, Tortosa G.a, Bedmar E.a
aDepartamento
de Microbiología del Suelo y Sistemas Simbióticos. Estación Experimental del Zaidín (CSIC). Apartado
Postal 419. 18080-Granada.
1. Introducción
El ciclo biogeoquímico del nitrógeno en la naturaleza está integrado por tres procesos: fijación de
nitrógeno (N), nitrificación y desnitrificación. La desnitrificación consiste en la reducción del nitrato
(NO3-) hasta nitrógeno molecular (N2), vía la formación de nitrito (NO2-), óxido nítrico (NO) y óxido
nitroso (N2O), en condiciones limitantes de oxígeno. Este proceso se lleva a cabo por las enzimas
nitrato reductasa (Nar/Nap), nitrito reductasa (NirK/NirS), óxido nítrico reductasa (Nor) y óxido
nitroso reductasa (NosZ), codificadas por los genes narG/napA, nirK/nirS, norC y nosZ,
respectivamente. El NO y el N2O son gases de efecto invernadero (GEIs), por lo que su
producción durante la desnitrificación es un seria amenaza medioambiental.
El empleo de oligonucleótidos específicos de genes de la desnitrificación y el desarrollo de
técnicas basadas en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), concretamente la PCR a
tiempo real (qPCR), han permitido la amplificación y cuantificación de tales genes a partir de
muestras medioambientales. La asociación de estas técnicas moleculares con la del análisis
estadístico (semivariograma) del comportamiento espacial de una variable sobre un área definida
hace posible estimar la distribución espacial de comunidades funcionales (mapa de Krige) en
muestras medioambientales.
El empleo de humedales artificiales para prevenir contaminaciones medioambientales es cada vez
más frecuente, y se ha revelado como un sistema de gran utilidad para reducir la contaminación
de suelos y aguas. Este es el caso de la laguna de los Guayules, un humedal que recoge las
aguas de regadío de las fincas agrícolas situadas en las inmediaciones del Parque Nacional de
Doñana (PND).
En este trabajo se ha estudiado la abundancia relativa del gen nosZ en 50 puntos del humedal de
los Guayules, se ha determinado la actividad desnitrificante en cada uno de los sitios de muestreo
y se ha analizado la relación entre la presencia del gen nosZ y la actividad desnitrificante de las
poblaciones microbianas. Finalmente, se ha construido el mapa de Krige relativo al gen nosZ.
2. Materiales y Métodos
Este estudio se llevó a cabo en el humedal de los Guayules (coordenadas UTM 29S 07211735,
4108590) del PND, en julio de 2010, en una zona acotada de 25 m x 50 m. La toma de
sedimentos se realizó en cada uno de los 50 puntos correspondientes a las intersecciones cada 5
x 5 m. La extracción de ADN de cada muestra se realizó siguiendo la metodología descrita por
Martin-Laurent et al. (2001). La abundancia del gen nosZ se cuantificó mediante qPCR utilizando
los oligonucleótidos y las condiciones de PCR indicadas por Henry et al. (2004). El gen 16S rRNA,
que se utilizó como marcador de la abundancia total del la población microbiana, se cuantificó de
la manera descrita por Philippot et al. (2009). La abundancia relativa del gen nosZ se calculó como
el cociente entre la abundancia de dicho gen y la del gen 16S rRNA, ambas expresadas como
número de copias del gen/ng de ADN. La actividad desnitrificante se determinó calculando la
producción de N2O en sedimentos frescos según Tortosa et al. (2011).
Para los análisis de correlación se empleó el programa SPSS 18 (IBM). El cálculo de los
semivariogramas y la construcción de mapas de Krige se llevó a cabo utilizando el soporte
informático GS+ 9 (Gamma Design Software).
3. Resultados y Discusión
La abundancia de los genes 16S rRNA y nosZ varió entre los puntos de muestreo con valores que
oscilaron entre 3,6 x 102-3,6 x 105 y entre 1 x 101-1.7 x 103 número de copias /ng de ADN,
respectivamente. Para todos los puntos de muestreo, de acuerdo con el índice rho de Spearman
(ρ = 0.52), se detectó cierta correlación entre el número de copias de los genes nosZ y 16S rRNA.
El análisis de semivarianza, ajustado a un modelo lineal, de la abundancia de los genes 16S rRNA
y nosZ para cualquier punto de muestreo indicó la ausencia de dependencia espacial, esto es, las
poblaciones desnitrificantes no se distribuyen de manera homogénea en distancias (rango)
superiores a 5 m. Sin embargo, cuando el análisis de varianza, empleando un modelo
exponencial, se basó en los datos de abundancia relativa, se observó la existencia de
dependencia espacial hasta un rango de 32 m y un valor de sill (comportamiento predecible) de
0.99. Consecuentemente con los datos anteriores, la construcción de un mapa de Krige basado en
los datos de abundancia de los genes nosZ y 16S rRNA mostró la ausencia de patrones de
distribución en el área de muestreo. Por el contrario, cuando el mapa se basó en los valores de
abundancia relativa del gen nosZ, los patrones de distribución espacial fueron evidentes (Figura
1). Para cada uno de los puntos de muestreo, los valores de actividad desnitrificante también
variaron ampliamente. El análisis de la varianza (modelo exponencial) de los datos obtenidos
reveló la existencia de agrupaciones espaciales en distancias máximas de 10 m, con un valor de
sill de 0,97. Consecuentemente, el mapa de Krige correspondiente presentó un claro patrón de
distribución espacial. No se pudo correlacionar la abundancia del gen nosZ y la emisión de N2O,
pero sí existió correlación entre abundancia relativa y emisión, lo que sugiere que la actividad de
la enzima óxido nitroso reductasa no se relaciona con la presencia del gen, pero sí con su
abundancia relativa. En conclusión, nuestros estudios indican que la distribución de las
poblaciones de bacterias desnitrificantes en un humedal artificial sujeto a inundaciones temporales
de agua contaminadas con nitratos debe estudiarse a distancias inferiores a 5 m. Si se considera
el tamaño que pueden ocupar en el espacio tales poblaciones, se puede prever que tales
distancias deben ser del orden de micras.
0m
50 m
Figura 1. Distribución espacial (mapa de
Krige) de la abundancia relativa del gen nosZ
en el humedal de los Guayules (Parque
Nacional de Doñana)
25m
Referencias
Henry S., Bru, D., Stres, B., Hallet, S., y Philippot, L. 2006. Quantitative detection of the nosZ
gene, encoding nitrous oxide reductase, and comparison of the abundances of 16S rRNA, narG,
nirK, and nosZ genes in soils. Appl Environ Microbiol 72, 5181-5189.
Martin-Laurent, F., Philippot, L., Hallet, S., Chaussod, R., Germon, J.C., Soulas, G., y Catroux. G.
2001. DNA extraction from soils: old bias for new microbial diversity analysis methods. Appl
Environ Microbiol 67: 2354-2359.
Philippot, L., Bru, D., Saby, N.P.A., Cuhel, J., Arrouays, D., Simek, M. et al. 2009. Spatial patterns
of bacterial taxa in nature reflect ecological traits of deep branches of the 16S rRNA bacterial tree.
Environ Microbiol 11: 1518-1526.
Tortosa, G., Correa, D., Sánchez-Raya, A.J., Delgado, A., Sánchez-Monedero, M.A., y Bedmar,
E.J. 2011. Nitrate contamination, biogeochemical properties and biological activities in surface
waters and sediments of La Rocina stream (Doñana National Park, SW Spain): Greenhouse gas
emissions and denitrification. Ecol Eng 37: 539-548.