Download Canales activados por voltaje

Survey
yes no Was this document useful for you?
   Thank you for your participation!

* Your assessment is very important for improving the work of artificial intelligence, which forms the content of this project

Document related concepts

Potencial de acción cardíaco wikipedia, lookup

Corriente funni wikipedia, lookup

Canal iónico wikipedia, lookup

Potencial de acción wikipedia, lookup

Patch clamp wikipedia, lookup

Transcript
Universidad de Chile
Facultad de Ciencias
Curso de Fisiología General 2008
6
Canales activados por voltaje.
Rafaella Arancibia, Camila Fuentes, Jocelyn Heller, Francisca Lilienfeld
Universidad de Chile, Facultad de Ciencias, Curso de Fisiología general 2008
Introducción
Los canales iónicos activados por voltaje son proteínas transmembrana que forman verdaderos
túneles macromoleculares a través de la membrana plasmática, conduciendo a través de ellos
altas concentraciones de iones, siendo en el sistema nervioso el sodio y el potasio los iones
principalmente conducidos. El paso de estos iones está regulado por la diferencia de potencial
de la membrana, pues estos canales cambian su permeabilidad en respuesta a cambios en el
potencial eléctrico, dada su propiedad de excitablidad. Estos cambios en el potencial
transmembrana se deben a la corriente eléctrica generada por el flujo de cargas que circulan a
través de los canales. Los canales activados por voltaje juegan una parte fundamental en la
generación y propagación del impulso nervioso y en la mantención de la homeostasis celular. La
activación e inactivación de éstos son la base del potencial de acción que es la señal integrativa
que permite a las células excitables conducir información para distintos eventos fisiológicos. El
sensor de voltaje es una región de la proteína constituida por aminoácidos cargados, cuyas
cargas cambian dependiendo de los cambios en el campo eléctrico de la membrana, El
movimiento del sensor da inicio a un cambio conformacional en la “puerta” o gate del túnel
conductor y así se controla el flujo iónico.
En este trabajo práctico se estudió la propiedad de excitabilidad de los canales activados por
voltaje usando un modelo de un canal activado por diferencias de potencial eléctrico. El modelo,
creado en el software Excel, permite calcular la corriente conducida a través de una membrana
que contiene un solo canal. Dependiendo de la diferencia de potencial eléctrico, se puede
simular que el canal se encuentre en estado abierto o en estado cerrado, y sólo si se encuentra
abierto podrá este conducir corriente. Para el estudio de esta simulación se calcularán diferentes
variables que contribuyen en el conocimiento del comportamiento del canal. Estas variables son
la corriente i, la conductancia del canal g, el potencial eléctrico aplicado V, el potencial de
inversión de corriente Vi, y la fracción de tiempo que el canal se encuentra abierto P0.
1
Universidad de Chile
Facultad de Ciencias
Curso de Fisiología General 2008
Resultados
La tabla que se muestra a continuación (Tabla 1) contiene los valores dependientes del voltaje,
los cuales fueron actualizados por el simulador cada vez que cambiamos el valor del voltaje.
Voltaje
mV
0
10
20
20
30
40
50
60
70
80
80
90
100
100
100
Promedio
corriente
<i>
pA
-1,74
-1,36
-0,57
-0,71
0,95
3,36
6,60
10,59
16,44
22,15
22,36
27,95
34,33
33,73
34,10
Varianza
de la
corriente
tiempo
tiempo
corriente
abierto
abierto
cerrado
pA2
pA
mseg
mseg
20,38
-12,45
687
4313
10,28
-7,42
909
4091
3,22
-2,48
1212
3788
3,25
-2,46
1386
3614
3,50
2,47
1959
3041
15,91
7,47
2251
2749
41,07
12,50
2639
2361
75,24
17,51
3023
1977
101,68
22,49
3656
1344
119,91
27,46
4034
966
116,07
27,46
4073
927
128,98
32,49
4302
698
110,65
37,50
4577
423
129,14
37,50
4498
502
116,23
37,45
4552
448
Tabla 1: valores dependientes del voltaje.
eventos
84
100
92
109
126
135
131
138
105
94
101
84
65
73
69
Tras fijar los distintos potenciales eléctricos, el simulador computó el curso temporal de la
corriente medida en intervalos de un milisegundo, durante 5 segundos. Los gráficos de la figura1
muestran una época de un segundo.
2
Universidad de Chile
Facultad de Ciencias
Curso de Fisiología General 2008
Figura 1: registros de voltaje que pasa a través de la membrana. Se muestran respectivamente
10V, 40V y 100V.
Análisis de los resultados
Con los datos de la tabla 1 podremos calcular las variables necesarias y pertinentes para este
Trabajo práctico.
1) Corriente promedio y corriente del canal abierto.
Corriente promedio (pA)
40,00
y = 0,4993x - 12,461
30,00
corriente promedio canal
abierto
20,00
corriente promedio
10,00
Lineal (corriente promedio
canal abierto)
0,00
0
20
40
60
80
100
120
-10,00
-20,00
Voltaje (mV)
Gráfico 1: corriente promedio en función del voltaje y corriente promedio del canal abierto en
función del voltaje.
En el grafico 1 se observa que el voltaje y la corriente son directamente proporcionales. En el
caso de la corriente promedio se observa una curva sigmoidea y en el caso de la corriente
promedio del canal abierto se observa una relación representada por una recta. A partir de la
ecuación de la recta, que describe la corriente del canal abierto en función del voltaje, podemos
determinar el voltaje de inversión (Vi) y la conductancia unitaria (g) utilizando la ecuación (1):
i  gP(V  Vi )
(1)
La ecuación de la recta corresponde a la siguiente ecuación:
i = g · V + g · Vi
donde g corresponde a la conductancia unitaria, V al voltaje aplicado y Vi al voltaje al cual la
corriente se hace cero (voltaje de inversión).
3
Universidad de Chile
Facultad de Ciencias
Curso de Fisiología General 2008
La pendiente de la recta del gráfico 1 corresponde a (g):
g = 0,499 nS = 499 pS
12,461 = g · Vi
Vi = 25 mV
En cuanto a la relación entre la corriente promedio y la corriente del canal abierto, se observa
que a altos valores de potencial (sobre 50 mV) hay una similitud entre las curvas, presentándose
en ambas una relación prácticamente lineal entre los parámetros corriente y voltaje. Esta
similitud a altos valores de potencial eléctricose debe a que los canales permaneces gran parte
del tiempo abiertos, por tanto los eventos de no conducción (corriente igual a 0) son
porcentualemnte poco importantes. Por otro lado en los puntos de bajo voltaje, porcentualmente
los eventos de no conducción son mayores y por ello la corriente promedio es menor a la
unitaria.
2) La probabilidad P0
La probabilidad P0 es la probabilidad de encontrar el canal abierto, la cual calculamos para cada
voltaje aplicado. P0 la calculamos dividiendo la corriente promedio por la corriente cuando el
canal se abrió.
Voltaje
mV
P0
0
0,13937
10
0,18264
20
0,22926
20
0,28939
30
0,38523
40
0,44965
50
0,52779
60
0,60491
70
0,73094
80
0,80661
80
0,81448
90
0,86034
100
0,91553
100
0,89959
100
0,91051
Tabla 2: valores de P0 para cada voltaje aplicado.
4
Universidad de Chile
Facultad de Ciencias
Curso de Fisiología General 2008
1,00000
<i> todos/<i>abierto
0,90000
0,80000
0,70000
0,60000
0,50000
<i>
0,40000
0,30000
0,20000
0,10000
0,00000
0
20
40
60
80
100
120
Voltaje (mV)
Gráfico 2: P0 en función del voltaje.
Voltaje
Función de
(mV)
P0
Boltzmann
(b-c)^2
0
0,13937
0,136
0,0000
10
0,18264
0,192
0,0001
20
0,22926
0,262
0,0011
20
0,28939
0,262
0,0007
30
0,38523
0,348
0,0014
40
0,44965
0,444
0,0000
50
0,52779
0,545
0,0003
60
0,60491
0,643
0,0014
70
0,73094
0,730
0,0000
80
0,80661
0,802
0,0000
80
0,81448
0,802
0,0002
90
0,86034
0,859
0,0000
100
0,91553
0,901
0,0002
100
0,89959
0,901
0,0000
100
0,91051
0,901
0,0001
Tabla 3: tabla para realizar ajustes de mínimos cuadrados para la función de Boltzmann.
En este paso utilizamos la herramienta Solver para realizar un ajuste de mínimos cuadrados y
así encontrar los mejores valores para z y V0 y el mínimo valor de la suma de los cuadrados.
z= 1,013392913
V0= 45,5221906
Suma 0,0056
Para controlar la calidad del ajuste graficamos P en función del voltaje (en formato de puntos) y
Boltzmann en función del voltaje (en formato lineal).
5
Universidad de Chile
Facultad de Ciencias
Curso de Fisiología General 2008
<i> todos / <i> abierto
1,0
0,9
0,8
0,7
p
0,6
<i>/<i>abierto
0,5
Boltzmann
0,4
0,3
0,2
0,1
0,0
0
20
40
60
80
100
120
V, mV
Gráfico 3: P y Boltzmann en función del Voltaje.
Ahora podremos calcular la diferencia de energía libre de los canales abiertos y cerrados en
ausencia de potencial eléctrico utilizando la ecuación (2)
G  G0  zFV
(2)
Tenemos entonces, V = 0, por lo tanto ∆G = 0; nos queda que ∆G0 = -zFV0.
z y V0 los conocemos del ajuste de Boltzmann y F (número de Faraday) corresponde a 96500
coulomb mol-1.
∆G0 = -(1.013*0.0455*96500)= -4.447 kJ/mol
El valor de energía libre negativo resultante indica espontaneidad, por lo que la transición entre
los estados abierto y cerrado del canal serían termodinámicamente favorable.
A partir del ∆G0 calculamos la probabilidad de encontrar el canal abierto en ausencia de
potencial eléctrico (V = 0). Para ellos utilizamos la ecuación (3) que corresponde a la función de
Boltzmann para la probabilidad de encontrar el canal abierto.
P  
1
1 e
 zF (V V0 ) / RT
(3)
Donde R es la constante de los gases (8,314472 J K-1mol-1) y T es la temperatura en Kelvin, en
este caso 298 K.
P(∞)= 1/(1+exp-((zF/RT)(-Vo))=0,14
Cabe mencionar que la probabilidad de encontrar el canal abierto es menor a la que se
encuentra experimentalmente a 10mV. Esto es congruente con lo esperado, pues el cálculo fue
realizado para una condición de 0mV.
6
Universidad de Chile
Facultad de Ciencias
Curso de Fisiología General 2008
3) Conductancia
Utilizando la ecuación (1) calculamos la conductancia promedio de la membrana para cada
voltaje (Tabla 4).
Voltaje
Conductancia
(mV)
promedio (pS)
g·Po
0
69,54
9,69
10
90,63
16,55
20
114,61
26,28
20
143,79
41,61
30
188,57
72,64
40
223,20
100,36
50
263,47
139,05
60
302,20
182,81
70
364,91
266,72
80
402,39
324,57
80
406,26
330,89
90
429,76
369,74
100
457,48
418,84
100
449,52
404,38
100
454,35
413,69
Tabla 4: valores de conductancia promedio para cada voltaje.
500
450
contuctancia (pS)
400
350
300
250
200
150
100
50
0
0
20
40
60
80
100
120
Voltaje (mV)
Gráfico 4: conductancia promedio en función del voltaje.
4) Determinación de la varianza de la conductancia
Utilizando la ecuación (4) determinamos la varianza de la conductancia promedio, para luego
realizar el gráfico de la varianza en función de la conductancia (gráfico 5). Los parámetros de la
parábola los ajustamos utilizando la herramienta Solver.
g
 g g 
N
2
2
g
(4)
Donde N es el número de canales en la membrana. En este caso N =1.
7
Universidad de Chile
Facultad de Ciencias
Curso de Fisiología General 2008
Voltaje
(mV)
<g>
σg2
0
69,54
29884,39
10
90,63
37037,83
20
114,61
44089,89
20
143,79
51119,37
30
188,57
58594,24
40
223,20
61625,78
50
263,47
62134,22
60
302,20
59563,11
70
364,91
49041,38
80
402,39
38995,43
80
406,26
37798,32
90
429,76
29884,40
100
457,48
19131,22
100
449,52
22378,53
100
454,35
20424,36
Tabla 5: valores de la varianza de la conductancia promedio
Varianza vs promedio de la conductancia
70000
60000
y = -x 2 + 499,3x - 5E-10
R2 = 1
Sigma2(g), ps2
50000
40000
sigma2(g)
Parabola
30000
20000
10000
0
0,0
100,0
200,0
300,0
400,0
500,0
<g>, pS
Gráfico 5: varianza en función de la conductancia promedio.
5) Análisis de los eventos abiertos y cerrados
Calcularemos la probabilidad de encontrar un canal abierto (P) para cada valor de voltaje, a partir
de la división entre el número de unidades de tiempo que el canal estuvo abierto por el tiempo
total de la simulación (5 segundos).
8
Universidad de Chile
Facultad de Ciencias
Curso de Fisiología General 2008
Tiempo
Voltaje
abierto
P
(mV)
(mseg)
0
687
0,1374
10
909
0,1818
20
1212
0,2424
20
1386
0,2772
30
1959
0,3918
40
2251
0,4502
50
2639
0,5278
60
3023
0,6046
70
3656
0,7312
80
4034
0,8068
80
4073
0,8146
90
4302
0,8604
100
4577
0,9154
100
4498
0,8996
100
4552
0,9104
Tabla 6: Valores de probabilidad de encontrar el canal abierto para cada voltaje.
probabilidad de encontar el canal
abierto
1
0,9
0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
0
20
40
60
80
100
120
Voltaje (mV)
Gráfico 6: probabilidad de encontrar el canal abierto en función del Voltaje.
En el grafico 6 se observa que a medida que el potencial es mas positivo, hay una mayor
probabilidad de encontrar el canal abierto.
A partir del grafico se observa un aumento paulatino en la probabilidad bastante regular a
medida que aumenta el potencial, sin embargo a mayores potenciales (mayores a 80 mV) se
observa una disminución en la pendiente, la que tiende a un Po=1.
Los valores de <i>todos/<i>abierto y los de P son muy similares, ya que en ambos casos se
refieren a una razon entre los eventos de canal abierto versus todos los eventos, primero se
refiere a la corriente en cada evento y luego al tiempo de cada evento.
9
Universidad de Chile
Facultad de Ciencias
Curso de Fisiología General 2008
6) Determinación de las constantes α y β
n
n
Voltaje
(mV)
mseg-1
mseg-1
0
0.00029112
4.57E-04
10
0.00022002
4.15E-04
20
0.00016502
3.70E-04
20
0.0001443
3.97E-04
30
0.00010209
3.79E-04
40
8.8849E-05
4.02E-04
50
7.5786E-05
4.37E-04
60
6.6159E-05
6.71E-04
70
5.4705E-05
9.03E-04
80
4.9579E-05
9.33E-04
80
4.9104E-05
1.21E-03
90
4.649E-05
1.96E-03
100
4.3697E-05
1.66E-03
100
4.4464E-05
1.85E-03
100
4.3937E-05
1.72E-03
Tabla 7: Valores de α y β.
En la tabla anterior se muestra cómo la probabilidad de que se abra un canal cerrado por unidad
de tiempo (α), aumenta a medida que aumenta el voltaje aplicado (V). Para el caso de la
probabilidad de que se cierre un canal abierto por unidad de tiempo (β), la relación es inversa,
con su valor disminuyendo mientras aumenta el valor del voltaje. Esto concuerda con lo
previamente mencionado, a mayores potenciales aumenta la probabilidad de encontrar el canal
abierto.
0.0025
y = 0.0002e0.0238x
R2 = 0.9512
1/mseg
0.002
1/tabierto
0.0015
1/tcerrado
Expon. (1/tcerrado)
0.001
Expon. (1/tabierto)
0.0005
y = 0.0011e-0.0175x
R2 = 0.9326
0
0
20
40
60
80
100
120
Voltaje (mV)
Grafico 7. valores reciprocos del tiempo promedio para los eventos abierto y cerrado en funcion
del voltaje.
La interseccion entre ambas curvas ocurre al voltaje 41,27 mV lo que corresponde a Vo.
10
Universidad de Chile
Facultad de Ciencias
Curso de Fisiología General 2008
Conclusión
En el presente trabajo practico mediante la simulación en excel de un canal activado por
voltaje se pudieron ilustrar una serie de sus propiedades.
Es posible observar a partir del grafico 1 que la corriente promedio describe una curva
sigmoidea en funcion con el aumento en el voltaje aplicado. En cambio, la corriente unitaria
describe una línea recta, cuya pendiente corresponde a la conductancia unitaria. A voltajes mas
positivos se observa que ambas corrientes tienden a igualarse.
Por otra parte la probabilidad de apertura del canal muestra una curva sigmoidea (grafico
3) en relación al aumento en el voltaje. Esta tiende a P=1 para voltajes superiores a 80 mV
aproximadamente, se observa un plateau al final de la curva para voltajes cercanos a 100mV.
Con los valores de la corriente promedio, del potencial de inversión y del voltaje se pudo
calcular la conductancia promedio del canal, la cual arrojó un valor de 454 pS. Cuando se graficó
la varianza de la conductancia en función de la conductancia promedio se encontró que la curva
era una parábola, donde la pendiente de dicha curva representaba a la conductancia. Se
observa una diferencia entre esta conductancia obtenida a traves de la parabola y aquella
previamente calculada, esto seria causado por error en algun paso de los calculos lo que causó
esta diferencia la que también se observa en la discrepancia entre el valor de conductancia <g>
calculado v/s el valor del producto g*Po.
11
Related documents
Los canales de iones son las estructuras responsables del
Los canales de iones son las estructuras responsables del