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DETERMINACIÓN DE LA ESTRUCTURA DE LAS PROTEÍNAS
Determining the Structure of Proteins
Tomado de: Brum, G, L. McKane y G. Karp. (1994) Biology: Exploring Life. New York, John Wiley & Sons, Inc.
Traducción Irene Quiroz Amenta
De las muchas substancias que se encuentran en los organismos, las proteínas tienen la estructura más compleja y llevan a
cabo las funciones más variadas. A final de la Segunda Guerra Mundial, en 1945, sabíamos muy poco de la estructura de estas
moléculas tan importantes; quince años después, los científicos habían adquirido una imagen detallada de cómo estaban constituidas
estas sustancias. En ese tiempo, un puñado de investigadores, usando diferentes técnicas, no sólo cambió nuestra manera de ver las
proteínas sino que cambiaron nuestro entendimiento acerca de la vida a nivel molecular.
Los científicos de la mitad de la década de los 40 sabían que las proteínas estaban constituidas de pequeñas moléculas
denominadas aminoácidos, unidos entre sí para formar entidades denominadas polipéptidos. Lo que no sabían era sí la secuencia de los
aminoácidos en una proteína era de importancia, y si este era el caso, ¿qué tan importante?
Frederick Sanger, un joven químico de la Cambridge University de Inglaterra, empezó sus investigaciones para determinar el
orden de los aminoácidos que tenía la insulina. Era una de las pocas proteínas que se podían conseguir fácilmente (se extraía de los
cerdos y era usada para el tratamiento de la diabetes). También era una proteína fácil de secuenciar, pues posee menos aminoácidos
que la mayoría de la proteínas (Sanger encontró que estaba constituida por 51 aminoácidos).
Cuando Sanger inició sus estudios, la determinación de la secuencia de los aminoácidos era un proceso largo y tedioso. Lo más
importante era el hecho de que sólo se podían secuenciar al mismo tiempo, cadenas de cinco aminoácidos.
Podemos usar una analogía con una cadena de letras como la siguiente:
TCEJBUSETIROVAFYMSYGOLOIB.
¿Cómo podrías determinar la secuencia si sólo fueras capaz de identificar cinco letras de la cadena? Si cortas la cadena de
letras en sitios diferentes y encimas los fragmentos similares, estarás en posibilidad de determinar la secuencia completa de la cadena de
letras.
TCEJB
JBUSE
SETIR
TIROV
OVAFY
Esto es precisamente lo que hizo Sanger. Cortó al azar químicamente las cadenas purificadas de polipéptidos, luego secuenció
los fragmentos hasta determinar toda la cadena de aminoácidos. Todo el trabajo de Sanger y sus colegas duró diez años.
Las secuencias obtenidas por Sanger, mostraron que la insulina tenía un orden preciso de aminoácidos. El examen de otras
proteínas mostró que tenían su propia secuencia estable de aminoácidos. No hay reglas preestablecidas que señalen cuál es la
secuencia de aminoácidos de un determinado péptido; cada secuencia es única y sólo puede ser revelada experimentalmente. Sanger
puso las bases para poder comprender las funciones de las proteínas basadas en las propiedades químicas de sus aminoácidos.
Mientras Sanger estaba trabajando en la secuenciación de los aminoácidos, en Inglaterra, Linus Pauling del Institute of
Technology de California, estaba trabajando en la organización tridimensional de un polipéptido.
Pauling utilizó modelos moleculares para determinar cómo se unían los aminoácidos de una manera estable. En 1948, mientras
se encontraba en Inglaterra, Pauling dibujó los átomos y los enlaces de un polipéptido. Conforme plegaba el papel en diferentes
posiciones, descubrió que cuando el polipéptido se encontraba formando una especie de escalera de caracol, los enlaces de hidrógeno
encajaban perfectamente, dándole a la molécula su máxima estabilidad. Pauling llamó a esta estructura en espiral alfa-hélix.
Mientras tanto. John Kendrew y Max Perutz de la Universidad de Cambridge, intentaban determinar la forma de una proteína
completa. Usaron una técnica llamada de cristalografía de rayos X, en la cual, una muestra de una substancia purificada era
bombardeada con rayos X. Los rayos X eran desviados por la muestra y se registraban sobre una placa fotográfica, produciendo un
patrón de puntos, que, cuando se interpretaba matemáticamente, revelaba la estructura de la molécula. Pauling había usado la
cristalografía de rayos X en su análisis de aminoácidos, pero esta era la primera ocasión en que la técnica se aplicaba a una proteína
compleja.
La primera proteína elegida por Kendrew y Perutz para su estudio con cristalografía de rayos X fue la mioglobina, una proteína
que almacena oxígeno en el tejido muscular. La fotografía reveló una molécula compacta cuya cadena polipeptídica se plegaba de una
manera irregular. Se descubrió que las proteínas no sólo tenían una secuencia única de aminoácidos, sino que poseían una estructura
tridimensional única que encajaba perfectamente con su función específica. Además, ocho de los segmentos de la proteína estaban
compuestos por alfa-hélices, las cuales en total representaban el 70% de los aminoácidos de la proteína. Pauling estaba fascinado por los
descubrimientos.
Recibió el Premio Nobel de Química en 1954. Cuatro años después, Sanger, y en 1962, Perutz y Kendrew recibieron el Premio.
TRANSPORTE DE MEMBRANA, FIBROSIS QUÍSTICA, Y LOS PROSPECTOS PARA LA TERAPIA GÉNICA. 1
Las proteínas de transporte que se encuentran en la membrana juegan un importante papel al facilitar y controlar el movimiento
de moléculas y de iones hacia dentro y hacia fuera de las células. Para permanecer sanos, nuestros cuerpos dependen del
funcionamiento adecuado de esas proteínas de membrana. Si cualquiera de ellas está defectuosa, el movimiento de un ion particular o
molécula a través de la membrana se deteriorará, y sobrevendrá la enfermedad.
Un ejemplo que ha traído la atención de los investigadores y de los médicos es la fibrosis quística (FQ), una enfermedad que
recientemente ha demostrado ser el resultado de un defecto genético que afecta a una proteína de transporte colocada en la membrana
plasmática. La fibrosis quística es una enfermedad común que típicamente afecta a los niños y a adultos jóvenes. Las partes del cuerpo
que son afectadas en forma más notable son los pulmones, el páncreas y las glándulas sudoríparas. Las complicaciones en los pulmones
son los problemas médicos más severos porque son difíciles de tratar y pueden llegar a ser una amenaza para la vida. Los conductos
respiratorios de un enfermo de FQ se obstruyen con un moco anormalmente espeso y son vulnerables a infecciones bacterianas crónicas,
especialmente por Pseudomonas aeruginosa.
Al usar las técnicas de la biología celular y molecular, los investigadores han adquirido una mejor comprensión de esta
enfermedad. Durante los años ochenta, se demostró que los enfermos de FQ mostraban un defecto en la secreción de iones cloro (Cl-).
Las células que recubren los pulmones sanos secretan iones cloro en respuesta a una sustancia llamada AMP cíclico, mientras que los
pacientes con FQ no lo hacían. (el AMP cíclico es una moléculas que está involucrada en una variedad de mecanismos reguladores en
las células).
Experimentos hechos con tejidos pulmonares de pacientes de FQ sugirieron que esta diferencia podía deberse a un defecto en
una proteína de membrana que normalmente sirve de canal para permitir el movimiento de iones de cloro a través de la membrana.
Muchos síntomas de FQ pueden explicarse por secreción defectuosa de iones de cloro. En los pulmones de una persona sana,
los iones cloro son secretados por las células que recubren los pasajes aéreos hacia el lumen ( lumen es el espacio que se encuentra
dentro de un conducto.) El movimiento de los iones cloro hacia el exterior de las células permite la salida de los iones sodio hacia el
lumen. La presión osmótica mayor del exterior de las células, permite que el agua salga inmediatamente después de los iones de sodio y
cloro, lo que resulta en la secreción de una solución diluida de sal. El agua que sale hacia el lumen provee una hidratación vital para el
recubrimiento mucoso de los pasajes aéreos.
En las células de las personas con FQ, los iones cloro no pueden salir al lumen, y como consecuencia, tampoco lo pueden
hacer los iones de sodio y el agua. Como resultado, la mucosidad de los pasajes aéreos está insuficientemente hidratado, lo que favorece
el crecimiento bacteriano.
A pesar de entender la relación que existía entre el transporte del ion cloro y la fibrosis quística, los investigadores fueron
incapaces de aislar la proteína que formaba el canal de cloro asociada con la FQ. Fue hasta 1989 cuando los investigadores del
1
Becker, W.M., Kleinsmith, L.J. y Hardin, J. (2000) The World of the Cell. Cuarta edición. The Benjamin/Cummings
Publishig Company. PP. 218-219.
laboratorio de Francis Collins de la Universidad de Michigan y de Lap-Chee Tsui y John Riordan de la Universidad de Toronto, aislaron el
gen que está defectuoso en los enfermos de FQ. Este gen codifica para una proteína transmembranal reguladora de la transmisión en la
fibrosis quística.
La secuencia de nucleótidos en el gen se determinó y al conocer esta secuencia, los científicos fueron capaces de predecir la
secuencia de aminoácidos y la estructura de la proteína reguladora. La proteína presenta dos dominios transmembranales que anclan la
proteína a la membrana plasmática y dos dominios en el interior del citoplasma a los que se unen moléculas de ATP, las cuales proveen
energía para que se transporten los iones cloro a través de la membrana. Además la proteína presenta un gran dominio citoplásmico
llamado dominio regulador que posee varios grupos serina que pueden ser reversiblemente fosforilados.
Se ha demostrado que esta proteína funciona como un canal para los iones cloro y que su función como canal se ve afectada
cuando los sitios de fosforilación que se encuentran en el dominio regulador se cambian debido a una mutación en el gen que codifica
para esta proteína.
Los investigadores han identificado más de 600 mutaciones en el gen. Las más comunes de estas mutaciones causan la
deleción de un simple aminoácido en el primer dominio donde se unen las moléculas de ATP. Se desconocía cómo la mutación causaba
la FQ, hasta que los investigadores examinaron la localización de la proteína en las células con y sin la mutación.
Las células normales presentaban esa proteínas en la membrana celular tal como se había predicho. En contraste, la proteína
mutada no pudo ser detectada en la membrana.
La explicación más verosímil es que la proteína normal se sintetiza en el retículo endoplásmico rugoso (RE), se desplaza hacia
el complejo de Golgi y finalmente se inserta en la membrana plasmática. Por otro lado, la proteína mutada, aparentemente queda
atrapada en el RE, tal vez porque se pliega en forma incorrecta. Por lo tanto se le reconoce como una proteína defectuosa y es
degradada. Consecuentemente, esta proteína no se presenta en la membrana plasmática de los individuos con FQ, de tal modo que la
secreción de iones cloro no se lleva a cabo, por lo que la enfermedad hace su aparición.
Con esta información acerca del gen y la proteína asociada con la FQ, los investigadores intentan desarrollar nuevos
tratamientos o tal vez una cura para la enfermedad. Un acercamiento promisorio es la terapia génica, en la cual una copia normal de un
gen se introduce dentro de las células afectadas. Los científicos desearían poder dirigir copias normales del gen que codifica para la
proteína directamente dentro de las células que recubren los pasajes aéreos de los pacientes. Estas células serían entonces capaces de
sintetizar la proteína correcta, la cual a diferencia de la proteína mutada se localizaría en la membrana plasmática permitiendo la
secreción correcta de los iones de cloro y, de esta manera se corregiría la enfermedad.
Sin embargo, existen problemas técnicos que tienen que resolverse para que la terapia génica funcione: el gen para el canal de
cloro debe ser dirigido correctamente al tejido infectado y su expresión debe ser regulada para que se obtenga y se mantenga su
producción normal.
En la mayor parte de los estudios clínicos, el gen normal se ha introducido dentro del los pacientes de FQ por dos medios: el
gen se incorpora al DNA de un virus denominado adenovirus o se mezcla con gotitas de lípido denominadas liposomas. La preparación
de virus o de liposomas se esparce mediante un aerosol en la nariz o en los pulmones del paciente de FQ. Posteriormente se investiga la
presencia de la proteína o el RNAm que compruebe que el gen se está expresando, o bien, la corrección del defecto que se demuestra
por un transporte correcto del ion cloro.
En experimentos iniciales realizados con ratones mutantes con FQ, varios grupos de investigadores británicos mostraron que el
defecto del canal del ion cloro podía ser corregido con un spray de liposomas –que contenían el gen normal humano— aplicado en el
tracto respiratorio. El mismo método se está usando ahora en pruebas con pacientes humanos. En uno de estos estudios, se ha
administrado nasalmente un spray de liposomas que contiene el gen normal.
En la mayoría de los pacientes se demostró que el gen fue colocado correctamente, pero su expresión fue de corta duración y el
defecto sólo fue parcialmente corregido.
Más recientemente, Eric Alton y sus colegas de Londres reportaron un experimento bien controlado en el cual administraron
liposomas con y sin el gen en la forma de un aerosol aplicado nasalmente y a los pulmones. Se obtuvo un significativo mejoramiento en
el transporte de cloro en los pacientes que recibieron el gen, pero no así en los pacientes que recibieron el tratamiento con el placebo
(sólo liposomas). Reportaron también una reducción en la adherencia bacteriana a las células del epitelio respiratorio en los pacientes,
hecho que tiene significación clínica relevante.
“La terapia génica para la fibrosis quística continúa haciendo progresos hacia el logro de una opción terapéutica realista para
esta enfermedad”, concluyeron Alton y sus colegas.
Este texto fue originalmente escrito por la Dra. Lisa S. Smit de la Universidad de Michigan.
En búsqueda de la doble hélice.2
“Nunca he visto a Francis Crick comportarse con modestia. Quizá lo haga en compañía de otras personas, pero yo nunca he tenido
motivos para juzgarle así.” Con esta observación típicamente irreverente como introducción, James Watson empieza a describir, en su
muy personal y altamente entretenido estilo los eventos que condujeron al descubrimiento de la estructura del DNA. El hecho, publicado
en 1968 bajo el título La doble hélice, es todavía una lectura apasionante acerca de la visión personal acerca de lo que significa un
descubrimiento científico.
Al comentar sobre las razones que tuvo para escribir este libro, Watson señala en el prefacio que “existe una ignorancia general
acerca de cómo se “hace” la ciencia. No quiere decir que toda la ciencia se haga de la manera como aquí se describe, pues los estilos de
investigación científica varían casi como varían las personalidades humanas. Pero, por otra parte, no creo que la forma en que se
descubrió la estructura del DNA constituya una extraña excepción en un mundo científico complicado por las contradictorias influencias
de la ambición y el sentido del juego limpio”.
De acuerdo con lo relatado por Watson, él y Crick eran muy diferentes, tanto en formación profesional como en carácter. Pero
había una cosa que compartían y era una manera no convencional y altamente productiva de hacer ciencia. Ellos, en realidad hicieron
muy pocos experimentos sobre el DNA, en lugar de ello, analizaron profundamente las investigaciones hechas por otros investigadores y
tuvieron la suficiente ingenuidad como para construir modelos y utilizar sus astutas intuiciones. De todo ello, emergió, en poco tiempo, un
modelo comprensible de la estructura de la doble hélice del DNA que se ha convertido en uno de los mayores sucesos del siglo XX.
Para apreciar sus hallazgos y su brillantez, debemos entender el contexto en el que trabajaron estos investigadores. La década
de los cincuenta del siglo xx fue una época excitante para la biología. Habían transcurrido pocos años desde que Avery, MacLeod y
McCarty publicaron las evidencias sobre la transformación genética de las bacterias, pero el trabajo de Hershey y Chase que confirmaban
que el DNA era el material genético, no había sido impreso.
Mientras tanto, en la Universidad de Columbia, los trabajos cuidadosos de Erwin Chargaff habían revelado que aunque las proporciones
relativas de las cuatro bases –A, T, C y G— variaban ampliamente de una especia a otra, era siempre la misma para todos los miembros
de una misma especie. El segundo hallazgo de Erwin fue más interesante: para una misma especie, la A y la T siempre se presentaban
en la misma proporción y lo mismo ocurría con la C y la G.
Las más importantes claves para desentrañar la estructura del DNA vinieron del trabajo de Maurice Wilkins y Rosalind Franklin
del King’s College de Londres. Wilkins y Franklin estudiaban el DNA con la técnica de refracción de rayos X. Esta técnica es una
herramienta útil para detectar la regularidad que se presenta en los elementos estructurales de una sustancia cristalina, debido a que
cualquier rasgo estructural que se repite a ciertos intervalos en el cristal contribuye a la formación de un modelo de difracción particular.
Los exhaustivos análisis que Franklin hizo de los modelos de difracción, mostraron que la molécula era larga y delgada, con
ciertos elementos estructurales que se repetían cada 0.34 nm mientras otros lo hacían cada 3.4 nm. Y, lo que era más intrigante, la
molécula parecía ser una especie de hélice.
Esto estimuló la imaginación de Watson y Crick, porque ellos habían oído recientemente que Linus Pauling hablaba de la estructura de
alfa hélice de las proteínas.
Watson y Crick utilizando modelos de nucleótidos hechos con cartón, llegaron a la comprensión de que el DNA era también una
hélice, pero con una importante diferencia: era una doble hélice, con puentes de hidrógeno que unían las bases pirimídicas con las
púricas. El descubrimiento está mejor relatado por las propias palabras de Watson:
2
Becker, W.M., L.J. Kleinsmith y J. Hardin. (2000) The World of the Cell. Cuarta edición. The Benjamin/Cummings
Publishing Company. PP.
A la mañana siguiente, cuando llegué a nuestro despacho, limpié de papeles mi mesa a fin de tener una superficie amplia en la
que formar pares de bases unidas por puentes de hidrógeno. Aunque al principio volví a mi idea de enlazar bases iguales, al poco rato
me di cuenta de que aquello no conducía a ninguna parte.
Cuando Jerry (Donohue, un cristalógrafo americano que trabajaba en el mismo laboratorio) entró, levanté la vista, pero al ver
que no era Francis empecé a combinar las bases en otras diversas posibilidades de emparejamiento.
De pronto me di cuenta de que un par adenina-timina unido por dos enlaces de hidrógeno tenía forma idéntica a la de un par
guanina-citosina. Todos los puentes de hidrógeno parecían formarse de un modo natural, y no se necesitaba ningún artificio para que las
dos pares de bases fueran idénticos en su forma. Al momento llamé a Jerry para preguntarle si tenía alguna objeción que hacer a mis
nuevos pares de bases.
Al responderme que no, sentí renacer mis esperanzas, pues sospechaba que ahora había encontrado la solución al enigma de
por qué el número de radicales de purina igualaba exactamente al número de radicales de pirimidina. Dos secuencias irregulares de
bases podían ser introducidas de un modo regular en el centro de una hélice, siempre que una purina se enlazara con un puente de
hidrógeno con una pirimidina. Además la exigencia de tal enlace de hidrógeno significaba que la adenina se emparejaría siempre con la
timina, mientras que la guanina se emparejaría solamente con la citosina. Las reglas de Chargaff emergían de pronto como consecuencia
de una estructura de doble hélice para el DNA. Y, lo que era más excitante, este tipo de doble hélice sugería un esquema de
multiplicación mucho más satisfactorio que mi idea de emparejar bases semejantes.
Emparejar siempre la adenina con la timina y la citosina con la guanina significaba que las secuencias de bases de las dos
cadenas eran complementarias una de otra. Dada la secuencia de bases de una cadena, quedaba automáticamente determinada la de su
compañera. Era muy fácil imaginar cómo una cadena aislada podía ser la plantilla para la síntesis de una cadena con la secuencia
complementaria.
Cuando Francis llegó, antes incluso de que cruzara por completo el umbral de la puerta ya le había comunicado que teníamos la
solución en nuestras manos. Aunque por cuestión de principio, mantuvo su escepticismo durante unos momentos, la forma similar de los
pares A-T y G-C produjo el impacto esperado. Y aunque se apresuró a disponer las bases en gran número de formas diferentes, no
pudimos encontrar ningún otro modo de satisfacer las reglas de Chargaff. Pocos minutos después, Francis observó el hecho de que los
dos enlaces glucosídicos (que unían una base y un azúcar) de cada par de bases estaban sistemáticamente relacionados por un eje
perpendicular al eje helicoidal. Así, ambos pares podían ser volteados y seguir teniendo sus enlaces glucosídicos apuntados en la misma
dirección. Esto tenía la importante consecuencia de que una cadena dada podía contener, al mismo tiempo, purinas y pirimidinas. Por
otra parte, sugería que las dos cadenas debían correr en direcciones opuestas.
La cuestión estaba entonces en saber si los pares de bases A-T y G-C encajarían fácilmente en la configuración de la cadena
ideada durante las dos semanas anteriores. Así parecía a primera vista, ya que en el centro yo había dejado libre un gran espacio para
las bases. Sin embargo, ambos sabíamos que no lograríamos el pleno éxito hasta no construir un modelo completo en el que todos los
contactos estereoquímicos fuesen satisfactorios. Estaba también el hecho evidente de que las implicaciones del modelo eran demasiado
importantes para arriesgarse a cantar victoria. Por eso sentí una ligera aprensión cuando, a la hora de comer, Francis se precipitó al
“Eagle” para decir a todos cuantos pudieran oírle que habíamos descubierto el secreto de la vida.”
El resto es historia. Poco después, la prestigiosa revista Nature publicó un artículo de dos páginas titulado simplemente
“estructura molecular de los ácidos nucleicos: Una estructura para el ácido desoxirribonucleico” por James Watson y Francis Crick.
Aunque modesto en longitud, este documento tendría implicaciones de alto alcance, puesto que el modelo de la doble hélice propuesto
en 1953 probó ser correcto en todos sus detalles esenciales y con ello desencadenó una revolución en el campo de la biología.