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RESOLUCION OIV-OENO 488-2013
REVISIÓN DE LA MONOGRAFÍA SOBRE LA DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD Β-GLUCANASA (ß 1-3, ß
1-6) EN LAS PREPARACIONES ENZIMÁTICAS (OIV-OENO 340-2010)
LA ASAMBLEA GENERAL
Visto el artículo 2 párrafo 2 iv del Acuerdo del 3 de abril de 2001 por el que se crea la Organización
Internacional de la Viña y el Vino,
Teniendo en cuenta los trabajos realizados por el grupo de expertos “Especificación de los productos
enológicos”
Considerando la resolución OIV-OENO 340-2010 adoptada por la OIV,
DECIDE, por propuesta de la Comisión II “Enología”, modificar la resolución OIV-OENO 340-2010 publicada en el Codex Enológico Internacional según las siguientes modificaciones señaladas:
DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD ß-GLUCANASA (ß 1-3, ß 1-6)
EN LAS PREPARACIONES ENZIMÁTICAS
Especificaciones generales
Estas actividades enzimáticas están presentes a menudo en las preparaciones enzimáticas complejas.
En la degradación de los ß-glucanos de Botrytis cinerea intervienen actividades endo-ß-glucanasas
del tipo endo-ß-1,3 y exo-1,6 ß-glucosidasas así como actividades del tipo exo-ß-1,3. Todas estas se
denominan comúnmente ß-glucanasas. Dichas preparaciones enzimáticas son capaces de degradar
los ß-glucanos en las paredes celulares de las células moribundas de la levadura Saccharomyces, lo
que contribuye al proceso conocido por el nombre de “élevage de vin sur lie” (crianza de vino sobre
lías). En este proceso intervienen actividades endo-ß-1,3 y endo-ß-1,6, así como actividades exo-ß1,3 y exo-ß-1,6. Salvo indicaciones contrarias, las especificaciones deben ajustarse a la resolución OENO 365-2009 relativa a las especificaciones generales para preparaciones enzimáticas que figuran en
el Codex Enológico Internacional.
1. ORIGEN
Se recomienda consultar el párrafo 5 “Fuente de la enzima y medio de fermentación” de la monografía general sobre las preparaciones enzimáticas.
Las preparaciones enzimáticas que contienen actividades ß-glucanasas se producen por fermentaciones dirigidas, por ejemplo, de Trichoderma harzianum, Trichoderma longibrachiatum (T. reesei) y
Penicillium funiculosum.
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2. ÁMBITO DE APLICACIÓN
Se recomienda consultar el Código Internacional de las Prácticas Enológicas, OENO 11/04; 12/04;
15/04 y 3/85.
Las preparaciones enzimáticas que contienen actividad ß-glucanasa (ß 1-3, ß 1-6) son capaces de hidrolizar los glucanos producidos por Botrytis cinerea (podredumbre noble y gris). Este polisacárido es la causa
de muchos problemas durante la clarificación y la filtración del vino. Por lo tanto, dichas beta glucanasas
se utilizan específicamente para la clarificación y la filtración de los vinos obtenidos a partir de uvas botritizadas.
Los glucanos de las paredes celulares de las levaduras también están hidrolizados por dichas ßglucanasas. Estas pueden utilizarse para mejorar el procedimiento de crianza sobre lías y la filtrabilidad.
3. FUNDAMENTO
El método de análisis se basa en la determinación cuantitativa de la glucosa liberada por la enzima, a
partir de una solución patrón de glucano Schizophyllum sp. común como sustrato.
3.1 Definición de las unidades:
La unidad β-glucanasa (β-Glu-U) se define como la cantidad de azúcares reductores (en forma de
glucosa) que se liberan en condiciones de laboratorio con 1 gramo (o 1 mililitro) de enzima por
minuto.
3.2 Papel de la enzima
Durante el desarrollo de Botrytis cinerea sobre las uvas infectadas, lo que se conoce como
podredumbre gris o noble, el hongo excreta un β-1,3-glucano en el que cada tres unidades de
glucosa hay una glucosilada en β-1,6. (fig. 1). Este glucano es muy similar al glucano sintetizado por
Schizophyllum sp. común.
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3.3 Fundamento de la medida
La actividad enzimática libera glucosa que, en medio básico, produce la reducción del ácido
3,5-dinitrosalicílico a ácido 3-amino-5-nitrosalicílico. El fenol aumenta la sensibilidad de la reacción.
El hidrogenosulfito de sodio fija la coloración.
4. EQUIPO
4.1 Espectrofotómetro y cubetas de 1 cm de paso óptico
4.2 Baño María 40 °C, 100 °C
4.3 Agitador magnético estándar
4.4 Agitador magnético múltiple, a 300 rpm
4.5 Recipientes de medida (matraces aforados, vasos de precipitados, matraces de Erlenmeyer, etc.)
4.6 Becher
4.7 Micropipetas
4.8 Cronómetro
4.9 Baño de ultrasonidos
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4.10 pHmetro
5. REACTIVOS Y PRODUCTOS
5.1 Sustrato
Disolución madre de glucano facilitada por la Universidad de Braunschweig1 y cuya concentración de
glucano ha sido determinada por dicha institución.
5.2 Sustancias puras
5.2.1 Ácido cítrico (monohidrato) (núm. CAS: 5949-29-1)
5.2.2 Hidróxido de sodio (núm. CAS: 1310-73-2)
5.2.3 Tartrato de sodio y de potasio (núm. CAS: 304-59-6)
5.2.4 Metabisulfito de sodio Na2S2O5 (núm. CAS: 7681-57-4)
5.2.5 Fenol (núm. CAS: 108-95-2)
5.2.6 Glucosa anhidra
5.2.7 Ácido 3,5-dinitro-2-hidroxibenzoico (3,5-dinitrosalicílico) (núm. CAS: 609-99-4)
5.2.8 Agua destilada
5.3 Disoluciones
5.3.1 Disolución de hidróxido de sodio 1 M
En un matraz aforado de 100 mL, disolver 4,0 g de hidróxido de sodio (5.2.2) con agua destilada
(5.2.8) y enrasar.
5.3.2 Disolución tampón de citrato (pH 4,0), 0,2 mol/L
En un matraz aforado de 500 mL, disolver 21,0 g de ácido cítrico monohidratado (5.2.1) con 400 mL
de agua destilada. Ajustar el pH a 4,0 con una solución molar de hidróxido de sodio (5.3.1) y enrasar
con agua destilada (5.2.8).
5.3.3 Disolución tampón de citrato (pH 4,0), 0,1 mol/L
En un matraz aforado de 1000 mL, disolver 21,0 g de ácido cítrico monohidratado (5.2.1) con 900 mL
de agua destilada (5.2.8). Ajustar el pH a 4,0 con una solución molar de hidróxido de sodio (5.3.1) y
enrasar con agua destilada (5.2.8).
5.3.4 Disolución de titulación: reactivo de color ácido dinitrosalicílico (DNS) con fenol.
Se prepara a partir de las disoluciones A, B y C siguientes:
5.3.4.1 Disolución A
Pesar 154,2 g de tartrato de sodio y de potasio (5.2.3) en un vaso de precipitados de 800 mL y
disolver totalmente en 500 mL de agua destilada (5.2.8). Añadir 9,7 g de hidróxido de sodio (5.2.2).
5.3.4.2 Disolución B
En un vaso de precipitados de 2000 mL, disolver totalmente 5,3 g de ácido 3,5-dinitrosalicílico (5.2.7)
en 500 mL de agua destilada (5.2.8). Los mejores resultados se obtienen con el baño de ultrasonidos.
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Prof. Dr. Udo Rau, Universidad Técnica de Braunschweig, Departamento de Bioquímica y Biotecnología.
Spielmannstr. 7, 38106 Braunschweig - Alemania
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5.3.4.3 Disolución C
En un vaso de precipitados de 100 mL, disolver 4,2 g de fenol (5.2.5) en 50 mL de agua destilada
(5.2.8). Añadir 1 g de hidróxido de sodio (5.2.2) y, una vez disuelto totalmente, 4,2 g de bisulfito de
sodio (5.2.4) y volver a disolver.
5.3.4.4 Disolución de glucosa al 0,3 %
Poner 300 mg de glucosa (5.2.6) en un matraz aforado de 100 mL, disolver en agua destilada (5.2.8) y
enrasar con esta.
5.3.4.5 Reactivo DNS con fenol
Mezclar las disoluciones A y C con la B en un vaso de precipitados de 2000 mL y tapar con papel de
aluminio.
Antes de utilizar, conservar al resguardo de la luz durante al menos 3 días.
Trasvasar el reactivo a un frasco de vidrio ámbar.
Puede conservarse durante un mes en un lugar oscuro y a una temperatura de entre 15 °C y 20 °C.
Cada vez que se vuelve a preparar un reactivo y antes de cada medición, deberá realizarse hay que
realizar un calibrado antes de proceder al análisis de la enzima.
Antes de cada uso, se han de añadir 3 mL de glucosa al 0,3 % (5.3.3.4) a 200 mL del reactivo DNS con
fenol.
5.3.5 Glucano en disolución al 0,1 %, pH 4,0
Pesar la cantidad exacta de disolución madre de glucano (5.1) necesaria para obtener una
concentración final de 1 g/L.
La disolución final de sustrato debe contener un 50 % de solución tampón de citrato (pH 4,0),
0,2 mol/L (5.3.2).
Para obtener 100 mL de disolución a partir de una disolución madre de glucano (5.1) que contenga
5,2 g/L, se toman 19,2 g y se pesan en un vaso de precipitados de 100 mL. Se añaden 50 mL de la
solución tampón de citrato (pH 4,0), 0,2 mol/L (5.3.2). Para obtener una mezcla homogénea, se
remueve durante al menos 15 minutos. Una vez la disolución esté bien homogeneizada, se ajusta el
pH a 4,0 con una solución molar de hidróxido de sodio (5.3.1). Posteriormente, se transfiere la
disolución a un matraz aforado de 100 mL y se enrasar con agua destilada (5.2.8).
Las disoluciones madres de glucano se almacenan a temperatura ambiente. Si se utiliza una nueva
disolución madre de glucano, se ha de determinar el factor de sustrato (Gf o factor de glucano)
mediante la enzima estándar. El factor Gf resulta indispensable para comparar los resultados
obtenidos con disoluciones madres distintas. El factor Gf se calcula a partir de una fórmula con los
valores medidos teniendo en cuenta que la actividad enzimática estándar es de 10000 β-Glu U/g
(véase el apartado correspondiente al cálculo de la actividad enzimática).
5.4 Preparaciones enzimáticas
5.4.1 Disolución enzimática estándar de glucanasa:
Se disuelven 0,5 g de la preparación enzimática estándar de glucanasa en 25 mL de la disolución
tampón de citrato (pH 4,0; 0,1 mol/L) (5.3.3) y se enrasa a 100 mL con agua destilada (5.2.8).
5.4.2 Para el resto de preparaciones enzimáticas:
Se toma 1 mL de la preparación enzimática, o 0,5 g si se trata de una preparación sólida en polvo o
granulado. Se disuelve en 25 mL de la disolución tampón de citrato (pH 4,0; 0,1 mol/L) (5.3.3) y se
enrasa a 100 mL con agua destilada (5.2.8). Si los valores de absorción son demasiado altos o
demasiado bajos, deberá realizarse una dilución adecuada. La disolución de enzimas deberá contener
un 25 % de disolución tampón de citrato (5.3.3).
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6. PROCEDIMIENTO
6.1 Ensayo en blanco del reactivo
En un matraz aforado de 50 mL, añadir 7 mL de reactivo DNS con fenol (5.3.4) a 3 mL de agua
destilada (5.2.8) y calentar durante 10 minutos en un baño María en ebullición. Enfriar el matraz
durante 5 minutos en hielo. Introducirlo después en el baño María a 20 °C y añadir agua destilada
(5.2.8) por debajo de la línea de enrase. Enrasar una vez transcurridos 10 minutos a 20 °C.
6.2 Curva de calibrado de la glucosa (con reactivo DNS con fenol)
Disolver 2,00 g de glucosa (5.2.6) en un matraz aforado de 200 mL y enrasar con agua destilada
(5.2.8). A partir de esta disolución, preparar la serie de disoluciones siguiente:
N.°
1
2
3
4
5
6
7
V solución patrón /
glucosa/100 mL
100 mL
2 mL
20 mg
50 mg
5 mL
100 mg
10 mL
150 mg
15 mL
200 mg
20 mL
300 mg
30 mL
400 mg
40 mL
glucosa (µg) en la muestra
(0,5 mL)
100 µg
250 µg
500 µg
750 µg
1000 µg
1500 µg
2000 µg
Pipetear 0,5 mL de cada disolución de la serie y ponerlos en matraces aforados de 50 mL. Añadir
7 mL del reactivo DNS con fenol (5.3.4) y 2,5 mL de agua destilada (5.2.8). Calentar los matraces
durante 10 minutos exactos en un baño María en ebullición. Enfriar durante 5 minutos en un baño de
hielo. Introducir los matraces en un baño María a 20 °C y añadir agua destilada (5.2.8) por debajo de
la línea de enrase. Enrasar una vez transcurridos 10 minutos a 20 °C. Con un espectrofotómetro,
medir la absorbancia de las disoluciones a 515 nm de longitud de onda respecto al blanco (que
contiene solo reactivo).
Representar en una gráfica la cantidad de glucosa en cada disolución de la serie frente a los valores
de absorción a 515 nm (fig. 2).
La curva de calibrado se debe elaborar el mismo día, antes de cada análisis de la enzima.
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µg Glucosa
Calibrado mediante el reactivo DNS de color con fenol
Figura 2
6.3 Ensayo en blanco de las enzimas
Pipetear 0,5 mL de las disoluciones enzimáticas (5.4.1 o 5.4.2) y ponerlos en matraces aforados de
50 mL. Añadir 7 mL del reactivo DNS con fenol (5.3.4). Mezclar con esmero y añadir 2,5 mL de la
disolución de sustrato (5.3.5). Mezclar bien agitando los matraces con la mano. Calentarlos en un
baño María en ebullición durante 10 minutos exactos. Enfriar los matraces durante 5 minutos en
hielo e introducirlos en un baño María a 20 °C. Añadir agua destilada (5.2.8) por debajo de la línea de
enrase. Enrasar una vez transcurridos 10 minutos a 20 °C. Con un espectrofotómetro, medir la
absorbancia de las disoluciones a 515 nm de longitud de onda respecto al blanco (que contiene solo
reactivo).
6.4 Medida de la actividad de las preparaciones enzimáticas
Para cada muestra, disponer 10 mL de sustrato (5.3.5) en un matraz de Erlenmeyer y calentar
durante 5 minutos en un baño María a 40 °C. Para homogeneizar las muestras se ha de utilizar un
agitador magnético múltiple a 300 rpm.
Transcurridos 5 minutos, se añaden 2 mL de las disoluciones enzimáticas (5.4.1 o 5.4.2) al primer
matraz e inmediatamente después se pone en marcha un cronómetro.
A continuación, añadir las disoluciones enzimáticas restantes a los demás matraces espaciando las
adiciones 30 segundos.
Agitar las muestras a 300 rpm a lo largo de toda la reacción.
Tras exactamente 15 minutos, se pipetean 3 mL de la primera mezcla y se transfieren a un matraz
aforado de 50 mL con 7 mL de reactivo DNS con fenol (5.3.4). Repetir la operación con todas las
mezclas, dejando transcurrir 30 segundos entre cada transferencia.
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Calentar en un baño María en ebullición durante 10 minutos exactos, respetando los 30 segundos de
diferencia entre muestra y muestra.
Enfriar los matraces durante 5 minutos en hielo e introducirlos en un baño María a 20 °C. Añadir
agua destilada (5.2.8) por debajo de la línea de enrase.
Enrasar una vez transcurridos 10 minutos a 20 °C. Con un espectrofotómetro, medir la absorbancia
de las disoluciones à 515 nm de longitud de onda respecto al blanco (que contiene solo reactivo).
La diferencia de absorbancia entre el blanco de las enzimas y el valor obtenido tras la reacción debe
estar entre 0,1 y 0,6 unidades.
Si los valores quedan por encima del intervalo de la curva de calibrado, repetir el experimento
realizando diluciones que se adapten a las enzimas.
Para cada muestra, proporcionar la medida del blanco de la enzima y los dos valores obtenidos al
medir por duplicado la absorbancia tras la reacción. Estos dos valores han de ser cercanos.
7. CÁLCULOS
Para calcular la actividad se utiliza la media. La actividad enzimática de una preparación enzimática
se calcula con la fórmula siguiente:
Actividad β-Glu-U por gramo o mililitro = (G × 200)/(15 × E) × 1/Gf
Nkat/g o mL = (Actividad β-Glu-Unidad/g o mL) X (1000/60)
G es la cantidad de azúcares reductores liberados, es decir, la media de los azúcares reductores
liberados (que se calcula a partir de los dos valores de absorbancia obtenidos tras la reacción) menos
el blanco (expresado en microgramos de glucosa a partir de la curva de calibrado).
E es la cantidad (en gramos o mililitros) de enzima diluida en 100 mL
200 corresponde al factor de dilución
15 corresponde al tiempo de reacción en minutos
Gf es el factor de glucano (a calcular)
Ejemplo:
Enzima
Valor
medido
1
2
0,621 0,618
Enzima utilizada
β-glucanasa
de
Penicillium
0,417
funiculosum
0,416
Blanco
(enzima)
E
Glucosa
(µg)
0,415
0,503
662
β-Glu-U por
gramo
o
miligramo
10325
0,023
1
1249
9799
Cálculo del Gf:
1 realizar la medición con el primer sustrato y la enzima estándar (valor 1)
2 realizar la medición con el nuevo sustrato y la enzima estándar (valor 2)
Cálculo: valor 1 / valor 2
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8. BIBLIOGRAFÍA
Bertrand A. Determinación de la actividad β-glucanasa de Botrytis en las preparaciones enzimáticas. OIV
FV 1263
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