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Mejora de Biocatalizadores por ingeniería de proteínas Bioq. Belén Infanzón, MSc Faculta de Ciencias Químicas Departamento de Biotecnología Faculta de Biología Departamento de Microbiología La catálisis es un proceso que aumenta la velocidad con la que una reacción alcanza el equilibrio. Dado que la velocidad de reacción depende de la energía libre de ac=vación, un catalizador provoca la disminución de la barrera de energía y acelera la etapa catalí=ca. Las enzimas son moléculas que pueden reducir la energía de ac=vación de la reacción y por lo tanto acelerar las reacciones bioquímicas que =enen lugar en la célula. Usos de los Biocatalizadores These strategies are: (1) screening for new suitable biocatalysts, (2) the use of
physico-chemical methods for biocatalyst improvement, and (3) using recombinant
Estrategias DNA
para obtener un mejor biocatalizador technology (directed evolution and/or rational protein design) for enzyme
para aplicaciones a escalas industriales improvement (Bornscheuer et al., 2002).
Figure I.4: Biocatalytic process development strategies (Bornscheuer et al., 2002)
Bornscheuer et al., Trends Biotechnol. 2002 23
Necesidades de modificación de una enzima •  Incrementar la estabilidad de la molécula •  Incrementar la eficiencia de la reacción •  Incrementar afinidad al sustrato •  Modificar el rango de sustrato •  Obtener nuevas ac=vidades catalí=cas •  Incrementar la tolerancia a bajas o altas temperaturas •  Incrementar la tolerancia a condiciones ácidas o alcalinas Sistemas para mejorar el rendimiento de la enzima • 
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Modificaciones fisico-­‐químicas Inmovilización Condiciones del crecimiento en cul=vos Clonación y sobreexpresión Inducción de la expresión de genes Manipulación genéKca de los genes que codifican a la enzima: mutagénesis Los retos para realizar la mutagénesis 1 Selección de un protocolo de mutagénesis apropiado, que permi=rá el acceso a una biblioteca suficientemente diversa 2 Diseño un método de cribado eficaz y adecuadamente de alto rendimiento (high-­‐throughput screening method) Bassegoda et al., 2013 Estrategias de mutagénesis Error-­‐prone polymerase chain reacKon (epPCR) Se pueden generar bibliotecas de secuencias mutantes con un número medio de uno, dos o más errores por secuencia Ciclo de Evolución dirigida Site-­‐saturaKon mutagenesis Se pueden generar suficiente clones (normalmente 300-­‐400 para un si=o). La biblioteca resultante contendrá mutantes con todos los 20 aminoácidos representados en el si=o elegido treated with DpnI for template plasmid removal (see 5.4.2) and then transformed into E.
Método coli
Quick-­‐ change competent
cells (see details in 5.6.1).
1)
2)
PCR
Plasmid carrying the
gene (gray) encoding
sequence of the enzyme
Template
plasmid
DpnI
digestion
Destruction of the
template plasmid
Template
plasmid
Figure M.1: Schematic illustration of the QuikChange PCR method (Stratagene)
1) Designed primers carrying the desired mutations; 2) Mutated gene (or library of genes).
Caster DNA shuffling La homología entre las secuencias originales separadas permite el cebado cruzado, y en úl=ma instancia resulta en una biblioteca de secuencias barajadas o revueltas. Estrategias de selección •  De alto rendimiento •  Suficientemente sensible •  Reproducible Estrategias de selección Kumar and Singh, 2013
Librería NNK para Y247 de Est23 •  Análisis estructura 3D -­‐ pymol Librería NNK para Y247 de Est23 •  Análisis de la secuencia obtenida por la técnica Quick-­‐change Librería NNK 5 clones 188 clones Cul=vo en placa Ac=vidad enzimá=ca Sustrato paranitofenil-­‐ octanoato Evaluación de Ac=vidad enzimá=ca Evaluación de Ac=vidad enzimá=ca 113% Librerías YDSL de LipR -­‐ 
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QC1: GGG QC2: GGS QC3: GGA QC5: AGA 5 clones -­‐  Librería D-­‐
NNK 188 clones -­‐  Librería Y-­‐
NNK 188 clones Librerías YDSL de LipR •  Gel de proteínas SDS-­‐PAGE 12%: Zimograma y =nción con Coomassie Wt QC1 QC2 QC3 QC4 QC5 Ac=vidad Rela=va 100 80 60 40 20 0 Bu=rato Heptanoato Oleato The evolu=on of enzyme discovery and protein engineering strategies used to iden=fy desired catalysts Desaeos •  U n a i n t e g r a c i ó n m á s e s t r e c h a e n t r e l a termodinámica y el desarrollo de procesos biocatalí=cos es altamente deseable para el diseño de nuevos procesos. •  Por otra parte, nuestra comprensión sobre la dinámica de proteínas es todavía muy limitada y esto hace que las predicciones sean dieciles basándose en la estructura cuaternaria. •  Se necesitan mejores técnicas para predecir en una etapa temprana de la ingeniería de proteínas que las mutaciones adicionales son posibles. •  El diseño informá=co de nuevas ac=vidades enzimá=cas no es exacto. Todavía se requieren 10-­‐20 predicciones y por lo general dan lugar a una enzima con baja ac=vidad. Gracias por la atención