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Ingeniería Genética
Fundación Barceló
Terapia Génica:
La terapia génica consiste en la inserción de una copia funcional normal de un
gen defectivo o ausente en el genoma de un individuo en las células de los
tejidos del individuo con el objetivo de restaurar la función normal del tejido y
así eliminar los síntomas de una enfermedad en general, y enfermedades
hereditarias en particular, así como para realizar un marcaje. Aunque la técnica
todavía está en desarrollo (motivo por el cual su aplicación se lleva a cabo
dentro de ensayos clínicos controlados), se ha utilizado con cierto éxito. A
pesar de que en un principio fue una técnica planteada exclusivamente con el
fin de tratar enfermedades genéticas, lo cierto es que en la actualidad se
propone para casi cualquier enfermedad, siendo un mecanismo de lo más
prometedor.
En los años 80, los avances en biología molecular habían permitido que genes
humanos fuesen localizados en el genoma y clonados. Científicos que
buscaban un método sencillo de producir las proteínas - tales como insulina,
por déficit de la molécula en la diabetes tipo 1 - introduciendo genes humanos
en el ADN bacteriano. Las bacterias modificadas entonces producían la
proteína correspondiente, pudiendo ser cultivada e inyectada en pacientes que
no podían producirla de forma natural.
El 14 de septiembre de 1990, investigadores de los Institutos Nacionales de la
Salud de los EE. UU. realizaron el primer procedimiento aprobado de terapia
génica en un paciente de cuatro años, Ashanthi DeSilva, el cual presentaba
una enfermedad genética rara denominada inmunodeficiencia combinada
severa (SCID), caracterizada por la ausencia de un sistema inmune
competente, por lo que era vulnerable a cualquier infección. Los niños con esta
enfermedad desarrollan generalmente graves infecciones y raramente llegan a
la edad adulta, de tal manera que enfermedades infantiles comunes como la
varicela son peligrosas para su supervivencia. Ashanthi tenía que estar aislado,
ya que debía evitar todo contacto con personas ajenas a su familia, mantener
un ambiente estéril de su hogar, y combatir las infecciones con gran cantidad
de antibióticos.

Aplicaciones

Marcado genético: El marcado genético no pretende la curación del
paciente sino que se usa para mejorar el tratamiento de una
determinada patología. Un ejemplo de ello sería la puesta a punto de
vectores para ensayos clínicos.

Terapia de enfermedades monogénicas hereditarias: Se usa en aquellas
enfermedades metabólicas en las que no se puede o no es eficiente la
administración de una proteína deficitaria. Se proporciona el gen
defectivo o ausente.
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
Terapia de enfermedades adquiridas: Entre este tipo de enfermedades
la más destacada es el cáncer. Se usan distintas estrategias, como la
inserción de determinados genes suicidas en las células tumorales o la
inserción de antígenos tumorales para potenciar la respuesta inmune.
Procedimiento
En el procedimiento de la terapia génica de Ashanthi, los doctores extrajeron
los glóbulos blancos del cuerpo del niño, dejaron las células crecer en el
laboratorio, insertando el gen que faltaba en las células, y después introdujeron
los glóbulos blancos modificados genéticamente dentro de la circulación
sanguínea del paciente. Las pruebas de laboratorio han demostrado que la
terapia consolidó el sistema inmune de Ashanthi; ya que no volvieron a
aparecer infecciones recurrentes, pudiendo asistir a la escuela, llevando una
vida normal e incluso ser vacunado contra tos ferina. Este procedimiento no era
curativo, ya que los glóbulos blancos tratados genéticamente solamente son
eficaces durante algunos meses, después de los cuales, el proceso debía ser
repetido (VII, Thompson [primer] 1993).
Aunque esta explicación simplificada del procedimiento de la terapia génica fue
todo un éxito, no supuso más que un primer capítulo optimista en una larga
historia; el camino al primer procedimiento aprobado de la terapia génica era
complicado y cargado de controversia.
Los científicos intentaron introducir genes directos a las células humanas,
centrándose en las enfermedades causadas por defectos de un solo gen, tales
como fibrosis quística, hemofilia, distrofia muscular y anemia falciforme. Sin
embargo, este proceso ha sido mucho más complicado que el realizado en
bacterias modificadas, sobre todo debido a los problemas derivados del paso
de secciones grandes del ADN a un lugar del genoma humano
comparativamente más grande.
En la mayoría de los estudios de la terapia génica, un gen “normal” se inserta
en el genoma para substituir un “anormal”. Un portador llamado vector se utiliza
para entregar el gen terapéutico a las células diana del paciente. Actualmente,
el tipo más común de vector son virus que genéticamente se han alterado para
llevar el ADN normal del ser humano. Los virus han desarrollado formas de
encapsular y entregar sus genes a las células humanas de un modo patógeno.
Los científicos han intentado reproducir esta capacidad manipulando el genoma
viral para quitar los genes causantes de la enfermedad e insertar los
terapéuticos.
Las células diana tales como las células del hígado o del pulmón del paciente
se infectan con el vector. El vector entonces descarga su material genético que
contiene el gen humano terapéutico en la célula diana. La generación de un
producto funcional de la proteína codificada por el gen terapéutico restaura la
célula diana a un estado normal.
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Logros
En teoría es posible transfectar las células somáticas (la mayoría de las células
del cuerpo) o las células del germinales (tales como gametos, y sus
precursores). Toda la terapia génica humana se ha centrado hasta ahora en las
células somáticas, mientras que su utilización en células germinales en seres
humanos sigue siendo solamente una perspectiva altamente polémica. Para
que el gen introducido sea transmitido normalmente al descendiente, necesita
no sólo ser insertado en la célula, sino también ser incorporado en los
cromosomas por recombinación genética.
La terapia génica somática se puede dividir en dos categorías: ex vivo (donde
las células se modifican fuera del cuerpo y después se trasplantan otra vez) e
in vivo (donde los genes se modifican directamente en células en el cuerpo).
Hay una variedad de diversos métodos para sustituir o para reparar los genes
alterados en la terapia génica.
Un gen normal se puede insertar en una localización no específica dentro del
genoma para sustituir un gen no funcional. Este acercamiento es el más
común. Un gen anormal se podría intercambiar por un gen normal con la
recombinación homóloga. El gen anormal se podría reparar con la mutación
reversa selectiva, que vuelve el gen a su función normal. La regulación (el
grado por el cual un gen se activa o inactiva)...
Normas para recibir la terapia génica
Las normas para recibir terapia génica están bien establecidas e incluyen
varios requisitos:

El gen debe estar aislado y debe estar disponible para la transferencia,
normalmente por clonación.

Debe haber un medio efectivo para la transferencia del gen. Por el
momento, muchos ensayos utilizan vectores retrovíricos, aunque
también se emplean otros métodos, como los vectores adenovíricos y
las técnicas físicas y químicas.

El tejido diana debe ser accesible para la transferencia genética. La
primera generación de procesos de terapia génica utiliza glóbulos
blancos o sus precursores como tejido diana.

No debe haber ninguna forma de terapia efectiva disponibles, y la
terapia génica no debe dañar al paciente.
Enfermedades tratadas por terapia génica
Aunque originalmente la terapia génica se desarrolló para tratar enfermedades
debidas a un único gen (monogénicas), esta técnica se adaptó rápidamente
para tratar enfermedades adquiridas como el cáncer y enfermedades
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infecciosas como el SIDA. Actualmente se están tratando también varias
enfermedades hereditarias, como la inmunodeficiencia combinada grave
(SCDI, del inglés Severe Combined Inmunodeficiency), la hipercolesterolemia
familiar, la fibrosis quística y la distrofia muscular, entre otras.
Fibrosis quística
En la fibrosis quística (CF, del inglés cystic fibrosis), una deleción denominada
∆508 (mutación) se encuentra en el 70 por ciento de todas las copias mutantes
del gen. La CF es una enfermedad autosómica recesiva asociada a un defecto
en una proteína denominada Regulador de la Conductancia Transmembrana
de la Fibrosis Quística (CFTR), que regula el transporte de iones por la
membrana plasmática. La CF afecta aproximadamente a 1 de cada 2000
personas descendientes del norte de Europa. Uno de los vectores que más se
han utilizado en la lucha contra la fibrosis ha sido el retroviral o retrovírico. Un
ADNc para el gen regulador de la conductancia transmembrana de la fibrosis
quística (CFTR) era construido por el solapamiento de tres clones ADNc, y un
ADNc completo era clonado en un vector retroviral. Las células CF eran
infectadas por dicho vector, que llevaba un gen CFTR, y la célula con el “virus”,
expresaban el gen CFTR.
Representación esquemática de la estructura propuesta para la CF.
Experimentos mostraron que las corrientes de cloro (uno de los iones que
atraviesan la membrana) se detectaban únicamente en las células CF con
CFTR. Significativamente, la respuesta de las células CF con CFTR es
comparable con las respuestas traqueales humanas normales y alienta la
esperanza de que la terapia génica sea efectiva en la fibrosis quística, usando
vectores retrovirales directamente sobre el epitelio pulmonar por medio de
aerosoles.
Hipercolesterolemia
Es una enfermedad hereditaria causada por mutaciones en el receptor de la
lipoproteína de baja densidad (LDLR), y aquellos pacientes que son
homocigotos para la mutación del gen de LDLR generalmente mueren por un
ataque al corazón antes de los 20 años. En este experimento, los vectores
retrovirales que llevan el gen para el LDLR humano se usan para infectar
cultivos de hepatocitos (células del tejido del hígado). Se obtuvieron así líneas
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celulares que eran capaces de degradar las lipoproteínas de baja densidad a
un nivel más o menos normal. Hasta ahora este experimento sólo se ha
utilizado en cultivos celulares, aunque es uno de los más seguros a probar en
individuos.
Inmunodeficiencia Combinada Severa (SCID)
La terapia génica empezó en 1990 con el tratamiento de una niña llamada
Ashanti De Silva que padecía la enfermedad.
Las personas afectadas no tiene un sistema inmunitario funcional y
normalmente mueren de infecciones leves. Ashanti tenía una forma autosómica
de SCID, y se debe a un defecto en el gen que codifica la enzima adenosina
desaminasa (ADA). Su terapia génica comenzó con el aislamiento de un tipo de
glóbulos blancos, denominados células T. Estas células, que formaban parte
del sistema inmunitario, se mezclaron con el vector retrovírico que llevaba una
copia del gen ADA normal insertada. El virus infectó muchas de las células T, y
una copia normal del gen ADA se insertó en el genoma de algunas de ellas.
Después de mezclar estas células con el vector y de producirse la infección, las
células T se cultivaron en el laboratorio y se analizaron para asegurar que el
gen ADA transferido se expresaba. El último paso de esta terapia génica fue la
inyección de mil millones de estas células T, genéticamente modificadas, en su
torrente sanguíneo. Algunas de estas células T emigraron hasta la médula
ósea de Ashanti, y empezaron a dividirse y a producir ADA. Del 25% al 30% de
las células T de Ashanti expresaban la proteína ADA, lo cual es suficiente para
permitirle llevar una vida normal. Otro ejemplo es el de David, "niño burbuja",
que tuvo que vivir en su cámara estéril para evitar cualquier riesgo de infección
ya que su sistema inmune no produce defensas al tener la mutación del gen
que codifica para la enzima adenosín desaminasa.
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Distrofia Muscular de Duchenne
El gen distrofina es el responsable de la distrofia muscular de Duchenne.
La Distrofia Muscular de Duchenne (DMD) es una enfermedad genética que
comienza en la infancia temprana, causando la pérdida progresiva de la fuerza
y volumen muscular. Aparece cuando un gen en el cromosoma X deja de
fabricar la proteína muscular esencial, la distrofina. Este gen es uno de los más
grandes en el cuerpo humano (ocupa casi un 1% del cromosoma X).
El 28 de marzo del 2006, en el Hospital Infantil en Columbus, Ohio, se inició un
ensayo en seis niños con DMD, que recibieron genes de reemplazo para la
proteína muscular esencial vía inyección en el bíceps de un brazo. Esta terapia
se desarrolló a partir de virus adeno-asociados, diseñados para llevar
específicamente el gen de distrofina a las células musculares.
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Cáncer
Los tratamientos habituales para esta enfermedad han sido la quimioterapia y
la radioterapia. La terapia génica se va a presentar como una posible arma
para la actuación contra esta enfermedad. Fundamentalmente, la terapia
génica se va a enfocar a la estimulación de la inmunidad natural hacia las
células tumorales, eliminarlas o inferir en su crecimiento con drogas, insertar un
gen supresor de tumores o frenar la resistencia a medicamentos. Se usan virus
con ciclo lítico y se hace que se activen sólo en células tumorales, con la ayuda
de promotores que solo sean activados en estos casos. Si infectan células
normales, este promotor no podrá ser activado y el gen introducido no se
activará. Pero puede darse otro caso, y es que para que se lleve a cabo el ciclo
lítico sea necesario la expresión de determinados genes tumorales. En el
segundo caso, se pone bajo un promotor de la célula tumoral, un gen que
exprese una enzima toxica. Esta enzima matará a la célula que la contiene y
además saldrá al exterior eliminando las células vecinas, que posiblemente
sean tumorales también.
Los vectores en la terapia génica
La gran diversidad de situaciones en las que podría aplicarse la terapia génica
hace imposible la existencia de un solo tipo de vector. Sin embargo, pueden
definirse características para un "vector ideal" y adaptarlas luego a situaciones
concretas.
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
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Reproducible.
Estable.
Que permita la inserción de material genético sin límite de tamaño.
Que permita la transducción tanto en células en división como
quiescentes.
Que posibilite la integración específica de un gen terapéutico.
Que reconozca y actúe sobre células específicas.
Que la expresión del gen terapéutico pueda ser regulada.
Que carezca de elementos que induzcan una respuesta inmune.
Que pueda ser caracterizado completamente.
Inocuo. Que minimice sus posibles efectos secundarios.
Fácil de producir y almacenar.
Coste razonable.
El sistema consta del "vector" propiamente dicho, que es el medio de
transporte, y el "cargo", el material transportado. Éste último consta a su vez de
dos componentes: El "efector", que es el gen que se pretende introducir, y el
"soporte", que son los elementos que controlan la expresión de dicho gen. El
más importante es el promotor, pero puede haber otros: potenciadores y
represores, secuencias de aislamiento, de integración, de empaquetamiento,
de recombinación homóloga, secuencias inmunoestimulantes,...
Se pueden separar en dos tipos de vectores para hacer terapia génica:
vectores virales y vectores no virales. Los vectores virales presentan una alta
eficiencia de transformación, pero una baja especificidad de tejido –infectan
toda célula que tenga receptores para los virus usados-. Por el contrario, los
vectores no virales son altamente específicos de tejido –inyectamos ADN
desnudo o protegido con diversas moléculas directamente en el tejido que
queremos infectar- pero su eficiencia de transformación es baja.
Virus
Todos los virus se unen a sus hospedadores e introducen su material genético
en la célula huésped como parte de su ciclo de replicación. Este material
genético contiene “instrucciones” básicas de cómo producir más copias de
estos virus, haciendo que el cuerpo normal se convierta en una maquinaria que
sirva para cubrir las necesidades de los virus. La célula huésped llevará a cabo
estas instrucciones y producirá copias adicionales del virus. Esto conllevará a
un mayor número de células infectadas. Algunos tipos de virus insertan sus
genes físicamente en el genoma del huésped (una característica típica de los
retrovirus, como el VIH, que introduce la enzima transcriptasa inversa en el
hospedador y además usa su ARN para dar las “instrucciones”). Esto hace que
se mezclen los genes del virus con los genes de la célula huésped durante la
vida de dicha célula.
Se ha observado que los virus de este tipo pueden ser utilizados como vectores
para transportar genes “benignos” en una célula humana. Para ello se
eliminarían de los virus los genes que causan la enfermedad y luego se
sustituyen por los genes que codifican el efecto deseado (por ejemplo, la
producción de insulina en el caso de los diabéticos). Este procedimiento debe
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hacerse de tal manera que los genes que inserta el virus junto con el genoma
del hospedador permanezcan intactos.
Existen numerosos problemas que impiden que la terapia génica tenga éxito
mediante el uso de vectores virales, tales como:


Dificultad para la prevención de los efectos.
Hay que asegurar que el virus infecta las células del cuerpo y que el gen
insertado no perturbe cualquier otro gen vital del genoma.
Retrovirus
El material genético en los retrovirus es en la forma de moléculas de RNA,
mientras que el de sus hospedadores es de ADN. Cuando un retrovirus infecta
a una célula huésped, introduce su ARN junto con algunas enzimas,
principalmente la transcriptasa inversa (RT) y la integrasa (IN). Esta molécula
de ARN debe producir una copia de ADN de su molécula de ARN para poder
ser integrada en el material genético de la célula del huésped. El proceso de
producir una copia de ADN a partir de una molécula de ARN se denomina
transcripción inversa. Se lleva a cabo por una de las enzimas transportadas en
el virus, llamada transcriptasa inversa. Después de que esta copia de ADN se
encuentra libre en el núcleo de la célula huésped, debe ser incorporada al
genoma. Este proceso se realiza gracias a la enzima integrasa del virus. El
genoma viral contiene básicamente tres regiones, gag, pol y env, que codifican
para las proteínas de la cápsida, las proteínas víricas (RT, IN y proteasa) y
proteínas de la envuelta. Estas tres regiones están flanqueadas por dos largas
secuencias repetidas terminales o LTRs, indispensables para el inicio de la
síntesis del ADN vírico, su integración y la regulación de su expresión. Para
usar los retrovirus como vectores víricos para terapia génica se eliminan los
genes responsables de su replicación y se reemplazan estas regiones gag, pol
y env por el transgén seguido de un gen marcador (para detectar las células
infectadas). Del genoma vírico quedan sólo las terminaciones LTR y la región
psi, que precede a gag. Así se crean los vectores retrovirales genómicos
(VRGs). ¿Cómo producirlos a gran escala ahora si carecen de los genes
necesarios para ello? Introduciéndolos en líneas celulares empaquetadoras,
que contienen plásmidos ayudantes con las secuencias gag, pol y env. Las
secuencias gag-pol (no pueden separarse) y env se aportan en plásmidos
separados para reducir los riesgos de que se produzcan virus capaces de
replicarse por recombinación entre los distintos fragmentos. Al usar tres
plásmidos distintos (gag-pol, env y el VRG) se necesitan tres eventos de
recombinación homóloga para producir virus que sean capaces de replicarse.
Es poco probable que esto ocurra. Últimamente se está estudiando el uso de
vectores que auto-inactivan sus secuencias LTRs una vez se han integrado en
el genoma de la célula diana. Esto evita que se empaqueten las secuencias
integradas en el caso de que se produjera en el organismo una infección por
retrovirus, con la consecuente dispersión del virus que hay integrado por el
organismo y su infección a otras células no específicas.
Una vez que el material genético del retrovirus se incorpora y se ha convertido
en parte del material genético de la célula huésped, si esta se divide después,
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sus descendientes contendrán todos los nuevos genes. Aunque algunas veces
los genes de los retrovirus no se expresan inmediatamente. Uno de los
problemas de la terapia génica con la utilización de retrovirus es que la enzima
integrasa puede insertar material genético de los retrovirus en posiciones no
arbitrarias en el genoma del huésped, y si el material genético se inserta en
medio de un gen original, este gen se verá perturbado (mutagénesis de
inserción). Si por ejemplo, el gen regula la división de la célula, ésta se verá
descontrolada. Ensayos de terapia génica utilizando vectores retrovirales para
tratar la inmunodeficiencia combinada grave ligada al cromosoma X (X-SCID)
representan la aplicación más exitosa de la terapia hasta la fecha. Así, más de
veinte pacientes han sido tratado en Francia y Gran Bretaña, con una alta tasa
de reconstitución del sistema inmunitario. Sin embargo, ensayos similares
fueron restringidos en los Estados Unidos cuando se informó de la aparición de
leucemia en pacientes. Hasta hoy se conocen cuatro casos de niños franceses
y uno británico que han desarrollado leucemia como resultado de mutagénesis
por inserción de los vectores retrovirales, y todos menos uno de estos niños
respondieron bien al tratamiento convencional contra la leucemia. En la
actualidad, la terapia génica para tratar SCID continúa siendo exitosa en USA,
Gran Bretaña, Italia y Japón.
Adenovirus
Son virus que llevan su material genético en forma de doble cadena de ADN.
Causan infecciones humanas respiratorias, intestinales y otras que afectan a
los ojos (especialmente el resfriado común). Cuando estos virus infectan a la
célula huésped, introducen su molécula de ADN. El material genético de los
adenovirus no es incorporado en el material genético del hospedador. La
molécula de ADN permanece libre en el núcleo del huésped y las instrucciones
en la molécula de ADN extra se transcriben como cualquier otro gen. La única
diferencia es que estos genes extra no se replican cuando la célula está a
punto de experimentar la división celular, de modo que los descendientes de
las células no tienen el gen extra. Como resultado, el tratamiento con el
adenovirus requerirá una creciente población de células, sin embargo, la
ausencia de éste en el genoma del hospedador debería prevenir la
mutagénesis de inserción.
Virus Adenoasociados (VAA)
Son pequeños virus con un genoma de ADN monocatenario. Pueden insertar
material genético en un lugar específico en el cromosoma 19, con casi un
100% de certeza. Sin embargo, el VAA recombinante, que no contiene ningún
gen viral, solo el gen terapéutico, no se integra en el genoma. En su lugar, el
genoma vírico recombinante fusiona sus extremos a través del ITR
(repeticiones terminales invertidas), apareciendo recombinación de la forma
circular y episomal que se predice que pueden ser la causa de la expresión
génica a largo plazo. Podemos encontrar ciertas desventajas con la utilización
del VAA, como la pequeña cantidad de ADN que puede llevar (baja capacidad)
y la dificultad en su elaboración. Este tipo de virus está siendo utilizado, sin
embargo, porque es un virus no patógeno (la mayoría de las personas son
portadoras de este virus inofensivo). A diferencia de los adenovirus, en la
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mayoría de los pacientes tratados con VAA no aparecen respuestas inmunes
para eliminar el virus ni las células con las que han sido tratados. Muchos
ensayos con VAA están en curso o en preparación, principalmente en el
tratamiento de músculos y enfermedades oculares, los dos tejidos donde el
virus parece ser particularmente útil. Sin embargo, se están comenzando a
realizar pruebas clínicas, donde vectores del VAA son utilizados para introducir
los genes en el cerebro. Esto es posible porque VAA pueden infectar células
quiescentes (que no se dividen), tales como las neuronas.
Herpes virus
Son virus de ADN cuyas células diana son las neuronas. Su complejidad y lo
poco que todavía conocemos de esta familia de virus, dificulta su utilización. La
gran ventaja es el gran tamaño de su ADN, que les permite aceptar varios
genes terapéuticos. Uno de los inconvenientes es que habría que eliminar las
secuencias que codifican las proteínas líticas del virus que causa la muerte de
las células a las que infecta.
Proteína "pseudotyping" de vectores virales
Los vectores virales descritos anteriormente tienen poblaciones naturales de
células huésped que ellos infectan de manera eficiente. Los retrovirus
presentan limitados los tipos naturales de hospedadores, y aunque los
adenovirus y virus adeno-asociados son capaces de infectar a un amplio rango
de células de manera eficiente, algunos tipos de células son refractarias a la
infección por estos virus. El ataque para entrar en una célula está mediado por
la proteína de envoltura de la superficie de un virus. Los retrovirus y virus
adeno-asociados tienen una única proteína de revestimiento en la membrana,
mientras que lo adenovirus están recubiertos con una envoltura de proteínas y
fibras que se extiende fuera de la superficie del mismo. La envoltura de
proteínas de cada uno de estos virus se une a las moléculas de la superficie de
la célula, tales como heparina, la cual se localiza sobre la superficie de células
hospedadoras potenciales, así como proteínas específicas de receptor que
también induce a cambios estructurales en la proteína del virus, o localiza el
virus en endosomas, donde la acidificación le lleva a éste a replegar su
revestimiento. En cualquier caso, la entrada en las células huésped requiere
una interacción favorable entre una proteína de la superficie del virus, y una
proteína de la superficie de la célula. Por la finalidad de la terapia génica, se
podría limitar o expandir el rango de células susceptibles a la transducción por
un vector de la terapia génica. Por ello, se han desarrollado muchos vectores,
en los cuales la cubierta vírica de proteínas ha sido remplazada por otros
revestimientos proteicos de otros virus, o por proteínas quiméricas. Esta
quimera constará de las partes de la proteína vírica necesaria para su
incorporación en el virión, así como las secuencias, supuestamente, a
interacturar con receptores específicos de proteínas celulares. Los virus en los
cuales el revestimiento proteico ha sido remplazado como se ha descrito, son
denominados virus pseudotyped. Por ejemplo, el vector más popular retrovírico
para el uso en pruebas de terapia génica ha sido el lentivirus, virus de la
inmunodeficiencia de Simian, revestido con la cubierta de proteínas G del virus
de la estomatitis vesicular. Este vector se conoce como VSV y puede infectar a
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casi todas las células, gracias a la proteína G con la cual este vector es
revestido. Se han hecho muchos intentos para limitar el tropismo (capacidad de
infectar a muchas células) de los vectores virales para una o varias poblaciones
de una célula huésped. Este avance podría permitir la administración
sistemática de una cantidad relativamente pequeña del vector. La mayoría de
los intentos han utilizado proteínas quiméricas para la envuelta, la cuales
incluían fragmentos de anticuerpos. Así, estos vectores pseudotyped parecen
ser una gran promesa para el descubrimiento de la “bala mágica” en las
terapias génicas.
Métodos no virales
Estos métodos presentan ventajas sobre los métodos virales, con una simple
producción a gran escala y una baja inmunogenicidad. Anteriormente, los bajos
niveles de transfección y expresión del gen mantenían a los métodos no virales
en una situación de desventaja; sin embargo, los recientes avances en la
tecnología de vectores han producido moléculas y técnicas de transfección con
eficiencias similares a las de los virus.
ADN desnudo
Éste es el método más simple de la transfección no viral. Consiste en la
inyección intramuscular de por ejemplo, un plásmido con ADN desnudo. Varios
de estos ensayos dieron resultados exitosos. Sin embargo, la expresión ha sido
muy baja en comparación con otros métodos de transfección, tiene una talla
ilimitada, no se integra en el genoma, y no amplifica el ADN. Además de los
ensayos con plásmidos, se han realizado ensayos con productos de PCR, y se
ha obtenido un éxito similar o superior. Este logro, sin embargo, no supera a
otros métodos, lo que a llevado a una investigación con métodos más eficientes
de ADN desnudo, tales como la electroporación, sonoparción, o el uso de un
“cañón de genes”, que dispara partículas de oro recubiertas de ADN hacia la
célula utilizando altas presiones de gas.
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Electroporación y microinyección, técnicas utilizadas como métodos no virales
en la terapia génica
Oligonucleótidos
El uso de oligonucleótidos sintéticos en la terapia génica consiste en la
inactivación de los genes implicados en el proceso de la enfermedad. Hay
varios métodos por los cuales esto se logra. Una estrategia, utiliza
oligonucleótidos antisentido (llamada, en este caso terapia antisense)
específicos para el gen diana y para alterar la transcripción del gen defectuoso.
Otra, hace uso de moléculas pequeñas de ARN llamadas siARN para señalar
la célula a la que se adhieren secuencias específicas y únicas en la
transcripción de ARN mensajero de un gen defectuoso, alterando la traducción
de los ARNm defectuosos, y por tanto la expresión del gen. Otra estrategia
utiliza oligodesoxinucleótidos como un señuelo para los factores de
transcripción que se requieren en la activación de la transcripción de los genes
objetivo. Los factores de transcripción se unen a los señuelos en lugar de al
promotor del gen defectuoso, lo que reduce la transcripción de los genes
objetivo, y de expresión. Además, oligonucleótidos de ADN de una sola
cadena, han sido utilizados para dirigir el cambio de un única base dentro de un
gen mutante.
Lipoplexes y poliplexes
Para mejorar la introducción de un nuevo ADN en la célula, éste debe ser
protegido de cualquier daño y su entrada en la célula debe estar facilitada. Para
este fin, nuevas moléculas, como liposomas y polisomas han sido creadas, y
tienen la habilidad de proteger el ADN de la degradación durante el proceso de
transfección. El ADN de plásmidos, puede ser cubierto por lípidos formando
una estructura organizada, como una micela o un liposoma. Cuando la
estructura organizada forma un complejo con el ADN entonces se denomina
lipoplexe. Hay tres tipos de lípidos: aniónicos (cargados negativamente),
neutros, o catiónicos (cargados positivamente). Inicialmente, lípidos aniónicos y
neutros eran utilizados en la construcción de lipoplexes para vectores
sintéticos. Sin embargo, estos son relativamente tóxicos, incompatibles con
fluidos corporales y presentan la posibilidad de adaptarse a estar en un tejido
específico. Además, son complicados y requieren tiempo para producirlos, por
lo que la atención se dirigió a las versiones catiónicas. Los lípidos catiónicos,
debido a su carga positiva, fueron los primeros usados para condensar
negativamente moléculas de ADN cargadas, de tal forma que facilitara el
encapsular ADN en liposomas. Más tarde, se constató que el uso de lípidos
catiónicos mejoraba la estabilidad de los lipoplexes. Además, como resultado
de su carga, los liposomas catiónicos interactúan con la membrana celular, y la
endocitosis se cree que es la principal vía por la que las células absorben los
lipoplexes. Los endosomas se forman como resultado de la endocitosis. Sin
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embargo, si los genes no pueden liberarse al citoplasma por rotura de la
membrana del endosoma, ellos enviarán los liposomas y todo el ADN será
destruído antes de que los genes puedan lograr sus funciones. También se
averiguó que aunque lípidos catiónicos por ellos mismos podían condensar y
encapsular ADN en los liposomas, la transfección eficiente es baja, debido a la
falta de habilidad en el “escape endosomal”. Sin embargo, cuando “lípidos de
ayuda” (normalmente lípidos electroneutrales, tales como DOPE) fueron
añadidos para formar lipoplexes, se observó una transfección eficiente.
Posteriormente, fue descubierto que ciertos lípidos tienen la capacidad de
desestabilizar la membrana del endosoma, para facilitar la fuga del ADN, y
estos lípidos se denominaron lípidos fusogénicos. Aunque liposomas catiónicos
han sido utilizados como una alternativa para la entrega de genes en los
vectores, la dosis depende de la toxicidad de los lípidos catiónicos, y se
observó que podrían limitar sus funciones terapéuticos. El uso más común de
los lipoplexes ha sido en la transferencia de genes en las células cancerosas,
donde los genes suministrados han activado los genes supresores del tumor en
la célula y han disminuido la actividad de los oncogenes. Estudios recientes
han mostrado que lipoplexes son útiles en las células epiteliales del sistema
respiratorio, por lo que pueden ser utilizados para el tratamiento genético de las
enfermedades respiratorias como la fibrosis quística. Los complejos de
polímeros de ADN se denominan poliplexes y la mayoría consisten en
polímeros catiónicos, regulados por interacciones iónicas. Una gran diferencia
entre los métodos de acción de poliplexes y lipoplexes es que poliplexes no
pueden liberar su ADN cargado al citoplasma.
Métodos híbridos
Debido a muchos métodos de transferencia de genes que presentan
deficiencias, se han desarrollado algunos métodos híbridos que combinan dos
o más técnicas. Los virosomas son un ejemplo, y combinan liposomas con el
virus inactivado VIH o el virus de la gripe. Esto ha demostrado tener mayor
transferencia de genes eficientes en células epiteliales del sistema respiratorio,
que cualquier otro método vírico o liposomal. Otros métodos implicados
mezclan vectores víricos con lípidos catiónicos o virus hibridados.
Dendrímeros
Un dendrímero es una macromolécula muy ramificada con forma esférica. La
superficie de la partícula puede ser funcional de muchas formas y algunas de
sus propiedades derivadas de su construcción están determinados por su
superficie. En particular, es posible construir un dendrímero catiónico, es decir,
con carga superficial positiva. Con la presencia de material genético como ADN
o ARN, dirigen su carga complementaria para la asociación del ácido nucleico
con el dendrímero catiónico. Al llegar a su destino, el complejo dendrímeroácido nucleico es entonces tomado por la célula a través de endocitosis. Los
dendrímeros ofrecen construcciones covalentes, robustas y un control extremo
sobre la estructura de la molécula. En conjunto,presentan más ventajas que los
lípidos catiónicos. La producción de dendrímeros ha sido históricamente un
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proceso ralentizado y caro, que consta de numerosas reacciones lentas, un
obstáculo que agrava su desarrollo comercial. La empresa Dendritic
Nanotechnologies, con sede en Michigan , descubrió un método para producir
dendrímeros utilizando la cinética química, un proceso que no solo reduce
costes en una magnitud de tres, sino que también acorta las reacciones de un
mes, a varios días. Estos nuevos dendrímeros “Priostar” pueden ser
construidos específicamente para transportar una carga útil de ADN o ARN que
transfiere a las células en una alta eficiencia y con una escasa o nula toxicidad.
Vacunas de ADN
Como todas las vacunas se busca la expresión de unas proteinas virales
determinadas a las que pretendemos provocar una respuesta inmune.
En un principio las vacunas consistian en virus atenuados, lo que presentaba
un cierto riesgo de biopeligrosidad. Una segunda generación de vacunas
consistian en la introducción de proteinas que producen una respuesta inmune
alta.
Actualmente estan en desarrollo las vacunas con ADN, que son mas seguros y
eficaces que los virus atenuados. Además son más fáciles de transportar. El
unico riesgo existente es que puedan llegar a integrar en el genoma. Se esta
experimentando en algunas enfermedades como el VIH,la malaria y el cancer,
administrandolos en forma de liposomas,inyecciones o biobalistica.
Porcentajes de ensayos en terapia génica
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Principales acontecimientos en la terapia génica
2002 y anteriores
La nueva terapia génica se enfoca a las reparaciones de errores del ARN
mensajero derivadas de genes defectuosos. Esta técnica tiene el potencial para
tratar enfermedades que afectan a la sangre, como la talasemia, fibrosis
quística y algunos cánceres. (11 de octubre del 2002)
Investigadores de Case Western Reverse University y Copernicus Therapeutics
son capaces de crear diminutos liposomas, de 25 nanómetros que pueden
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llevar ADN terapéutico a través de poros de la membrana nuclear. (12 de mayo
del 2002)
La enfermedad en células falciformes es tratada con éxito en ratones. (18 de
marzo del 2002)
En 1993 Andrew Gobea nació con una rara, y mortal enfermedad genética
(SCID). La sangre fue retirada de la placenta de Andrew y el cordón umbilical
también inmediatamente después de su naciemiento, que contienen células
madre. El alelo que codifica el gen adenosina desaminasa, ADA, fue obtenido e
insertado en un retrovirus. Los retrovirus y las células madre se mezclaron.
Después se insertó el gen en los cromosomas de las células madre, y éstas en
la sangre de Andrew. Durante cuatro años, las células T (glóbulos blancos),
producidos por las células madre, fabricaron enzimas ADA utilizando el gen
ADA. Después de cuatro años el niño requiso otra vez del tratamiento.
El éxito de un ensayo para el tratamiento de niños con SCID ( Sindrome de la
Inmuno deficiencia Combinada Severa o enfermedad de “niño burbuja”) que
tuvo lugar entre 2000 y 2002, fue cuestionada cuando dos de los diez niños
tratados en París desarrollaron leucemia como respuesta. Las pruebas clínicas
se interrumpieron temporalmente en el 2002, pero se reanudó después de la
revisión de la normativa de protocolo en los Estados Unidos, el Reino Unido,
Francia, Italia y Alemania. (3 de octubre del 2002)
2003
Un equipo de investigadores de la universidad de California, en Los Ángeles,
insertaron genes en el cerebro utilizando liposomas recubiertos de un polímero
llamado polietilen glicol (PEG). La transferencia de genes en el cerebro es un
logro significativo porque los vectores virales son demasiado grandes para
cruzar la “barrera hematoencefálica”. Este método tiene el potencial para el
tratamiento de la enfermedad del Parkinson. (20 de marzo del 2003)
La interferencia por ARN o el silenciamiento génico comienza a ser una nueva
forma de tratar la enfermedad de Huntington. Cortos fragmentos de ARN de
doble cadena ( short, interfering RNAs o siRNAs) son utilizados por las células
para degradar ARN de una secuencia particular. Si un siRNAs esta diseñado
para unirse a una copia de ARN de un gen defectuoso, entonces el producto de
la proteína anormal de ese gen, no se producirá. (13 de marzo del 2003)
2006
Científicos del Instituto Nacional de la Salud (Bethesda, Maryland) tratan
exitosamente un melanoma metastásico en dos pacientes, utilizando células T
para matar y atacar a las células cancerosas. Este estudio constituye la primera
demostración de que la terapia génica puede ser efectivamente un tratamiento
contra el cáncer.
En Marzo del 2006, un grupo internacional de científicos anunció el uso exitoso
de la terapia génica para el tratamiento de dos pacientes adultos contagiados
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por una enfermedad que afecta a las células mieloides. El estudio, publicado en
Nature Medicine, se cree que es el primero que demuestra que la terapia
génica puede curar enfermedades del sistema mieloide.
En Mayo del 2006, un equipo de científicos dirigidos por el Dr. Luigi Naldini y el
Dr. Brian Brown del Instituto de San Raffaele Telethon contra la Terapia Génica
(HSR-TIGET) en Milán, informaron de un avance para la terapia génica en el
que se desarrolló una forma de prevenir que el sistema inmune pueda rechazar
una entrada de genes. El grupo HSR-TIGET utilizó unos genes regulados por
moléculas conocidas como microRNAs. Los investigadores del Dr. Naldini
observaron que se podía utilizar esta función natural de los microRNA para
desactivar selectivamente la identidad de sus genes terapéuticos en las células
del sistema inmunológico y prevenir que el gen fuera encontrado y destruído.
Se inyectó el gen que contiene una célula inmune con microARN en ratones y
estos no rechazaron el gen. Este trabajo tiene implicaciones imortantes para el
tratamiento de la hemofilia y otras enfermedades genéticas de la terapia
génica.
2007
El 1 de mayo del 2007, el hospital Moorfields Eye y la universidad College
London´s Institute of Ophthalmology anunciaron el primer ensayo de terapia
génica para la enfermedad hereditaria de retina. La primera operación se llevó
a cabo en un varón británico de 23 años de edad, Robert Johnson, a principios
del 2007. La Amaurosis congénita de Leber es una enfermedad hereditaria que
causa la ceguera por mutaciones en el gen RPE65. Los resultados de la
Moorfields/UCL se publicaron en New England Journal of Medicine. Se
investigó la transfección de subretiniana por el virus recombinante adenoasociado llevando el gen RPE65, y se encontraron con resultados positivos.
Los pacientes mostraron un incremento de la visión, y sin efectos secundarios
aparentes.
2008
Investigadores de la Universidad de Michigan en Ann Arbor (Estados Unidos)
desarrollaron una terapia genética que ralentiza y recupera las encías ante el
avance de la enfermedad periodontal, la principal causa de pérdida de dientes
en adultos. Los investigadores descubrieron una forma de ayudar a ciertas
células utilizando un virus inactivado para producir más cantidad de una
molécula natural denominada receptor TNF. Este factor se encuentra en bajas
cantidades en los pacientes con periodontitis. La molécula administrada por
terapia genética funciona como una esponja que absorbe los niveles excesivos
de TNF, la cual empeora la destrucción ósea inflamatoria en pacientes que
sufren de artritis, deterioro articular y periodontitis. Los resultados del trabajo
mostraron que entre el 60 y el 80 por ciento de los tejidos periodontales se
libraban de la destrucción al utilizar la terapia génica. Ésta requiere una sola
administración, pero podría tener efectos durante toda la vida en los pacientes,
bajo riesgo de enfermedad grave.
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Problemas de la terapia génica y de sus aplicaciones
En los últimos años, se ha puesto en duda la seguridad de los ensayos
realizados con la terapia génica, a raíz de que en 1999 se hiciese pública la
noticia de la muerte de un paciente (Jesse Gelsinger, de 18 años), como
consecuencia del tratamiento de terapia génica al que estaba sometido para
intentar curar la deficiencia de la ornitina transcarbamilasa que padecía. La
modificación del material genético de una célula afecta tanto a la célula como a
sus descendientes. Los principales miedos se centran en las alteraciones
genéticas de la línea germinal.
Algunos de los problemas de la terapia génica son:
La naturaleza de la propia terapia génica hace que pacientes tengan que
someterse a múltiples rondas de terapia génica.
La respuesta inmune. Siempre que un objeto extraño se introduzca en los
tejidos humanos, el sistema inmune ha evolucionado para atacar al invasor. La
posibilidad de que el sistema inmune reduzca la eficacia de la terapia génica
existe. Además, el sistema inmunitario mejora su respuesta la segunda vez que
el invasor penetra en el organismo, por tanto es difícil que esta terapia génica
se pueda repetir en pacientes.
Problemas con los vectores virales. Podrían contaminarse tanto por
sustancias químicas o por el virus virulento. Recombinaciones indeseadas en
estos vectores podrían acarrear enfermedades con una virulencia impredecible
. Además presentan otros problemas como la toxicidad, respuestas inmunes e
inflamatorias, etc.
Trastornos multigénicos. Trastornos que surgen de mutaciones en un único
gen. Lamentablemente, algunos de los trastornos más comunes producen
enfermedades cardíacas, presión arterial alta, la enfermedad del Alzheimer,
artritis, diabetes... y son causados por los efectos combinados de las
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variaciones de muchos genes. Estos trastornos podrían ser especialmente
difíciles para el tratamiento eficaz con el uso de terapia génica.
Podrían darse modificaciones en células germinales. La introducción
involuntaria de genes en estas células expondría a la descendencia a un
altísimo riesgo.
Aunque en los ensayos no se ha dado transferencia (contagio) a otras
personas en contacto, esto aún no puede ser descartado. Los pacientes
tratados pueden tener vectores en sangre, heces, orina, semen...
Posibilidad de inducir un tumor (mutagénesis). Si el ADN se integra en el lugar
equivocado en el genoma, por ejemplo en un gen supresor tumoral, podría
inducir a un tumor. Esto ha ocurrido en los ensayos clínicos para SCID
(Inmunodeficiencia Combinada Severa) ligada al cromosoma X, en donde las
células madre hematopoyéticas de los pacientes se traducen utilizando un
retrovirus. Esto condujo al desarrollo de la leucemia en 3 de 20 pacientes. Sin
embargo, ante el riesgo de padecer un tumor maligno, existen también
estrategias, las cuales se reflejan en el cuadro:
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